A Modified Protocol for Plant Genome DNA Extraction PDF
Preview A Modified Protocol for Plant Genome DNA Extraction
植 物 分 类 与 资 源 学 报 ꎬ３６ ( ): ２０１４ ３ ３７５~３８０ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ : ＤＯＩ １０.７６７７/ｙｎｚｗｙｊ２０１４１３１５６ 一种改良的植物基因组 ＤＮＡ 通用提取方法∗ 陈林杨１∗∗ꎬ 宋敏舒２∗∗ꎬ 查红光２ꎬ 李志敏１∗∗∗ 云南师范大学生命科学学院 云南昆明 中国科学院昆明植物研究所 (１ ꎬ ６５００９２ꎻ ２ 东亚植物多样性与生物地理学重点实验室 云南昆明 ꎬ ６５０２０１) 摘要: 高质量的基因组 是分子生物学研究的基础 而从富含糖类和次生代谢物且异质性强的植物材 ＤＮＡ ꎬ 料中分离 相对困难 本方法在 法和商业 提取试剂盒的基础上 在裂解细胞之前 对植物 ＤＮＡ ꎮ ＣＴＡＢ ＤＮＡ ꎬ ꎬ 材料进行预处理 去除干扰 提取的代谢物 并在后续步骤中进行了一些优化 该方法适于多种不同 ꎬ ＤＮＡ ꎬ ꎮ 的植物种类 所提取的基因组 质量较好 能满足下一步基因操作的要求 是一种通用的植物基因组 ꎬ ＤＮＡ ꎬ ꎬ 提取方法 ＤＮＡ ꎮ 关键词: 植物基因组 通用 提取方法 植物材料 ＤＮＡꎻ ＤＮＡ ꎻ 中图分类号: 文献标识码: 文章编号: Ｑ７８ꎬ Ｑ９４３２ Ａ ２０９５－０８４５(２０１４)０３－３７５－０６ Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ １∗∗ ２∗∗ ２ １∗∗∗ ＣＨＥＮ Ｌｉｎ￣Ｙａｎｇ ꎬ ＳＯＮＧ Ｍｉｎ￣Ｓｈｕ ꎬ ＺＨＡ Ｈｏｎｇ￣Ｇｕａｎｇ ꎬ ＬＩ Ｚｈｉ￣Ｍｉｎ ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ ＹｕｎｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＰｌａｎｔＤｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄ (１ ꎬ ꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５００９２ꎬＣｈｉｎａꎻ２ ＢｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙｏｆＥａｓｔＡｓｉａ ＫｕｎｍｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ꎬ ꎬ ꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ : Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｉｓ ａ ｖｉｔａｌ ｓｔｅｐ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ. Ｂｕｔ ｉｔ ｉｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｒｉｃｈ ｉｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓꎬ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓꎬ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ. ＴｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂａｓｅｓｏｎｃｏｍｍｏｎＣＴＡＢａｎｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｋｉｔｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈ ｓｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄｆｅａｔｕｒｅｓｒｅｍｏｖｉｎｇｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌｐｒｉｏｒｔｏｔｈｅｃｅｌｌｌｙｓｉｓ. ＨｉｇｈｑｕａｌｉｔｙＤＮＡｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｏｍａ ｖａｒｉｅｔｙｏｆｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｍｅｔｈｏｄｓ. Ｗｅｄｅｍｏｎｓｔｒａ￣ ｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｓｏｍｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ : Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡꎻ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｏｍｍｏｎ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ 提取是分子生物学研究的基础技术 不同植物的次生代谢物含量和种类差异 ＤＮＡ ꎮ ２０１３)ꎮ 高质量的 是进行后续分子操作 如 扩 较大 同种植物的不同组织和器官的次生代谢物 ＤＮＡ ꎬ ＰＣＲ ꎬ 增 分子杂交 限制性酶切 基因克隆 遗传多 的含量和种类也不同 要从富含多酚和多糖的植 、 、 、 、 ꎬ 态性分析等研究的必要条件 与动物或微生物材 物组织中分离得到高质量的基因组 相对困难 ꎮ ＤＮＡ 料相比较 植物的总 提取相对困难 其原 等 等 等 ꎬ ＤＮＡ ꎬ (Ｂａｒｚｅｇａｒｉ ꎬ ２０１０ꎻ Ｓａｈｕ ꎬ ２０１２ꎻ Ｍｕｈａｍｍａｄ ꎬ 因是植物有较坚韧的细胞壁 且含有较多的多 其次 植物基因组 提取的起始材料 ꎬ ２０１３)ꎻ ꎬ ＤＮＡ 糖 脂类 多酚等次生代谢物 这些都有可能会 经常是干燥的组织甚至是保存多年的标本材料 、 、 ꎬ ꎬ 干扰 的提取 等 李金璐等 相对于新鲜材料 这类材料代谢物浓度更高且有 ＤＮＡ (Ａｍａｉｎｉ ꎬ ２０１１ꎻ ꎬ ꎬ 基金项目 国家基金委 云南省联合基金重点项目 国家自然科学基金 国家自然科学基金 ∗ : － (Ｕ１Ｂ６６０１)、 (３０３６００４９)、 (３１１７０２１６)、 云南省教学名师工程项目 并列第一作者 ∗∗ 通讯作者 ∗∗∗ : ＡｕｔｈｏｒｆｏｒｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｌｉｚｈｉｍｉｎ＿ｖｉｐ＠１６３ｃｏｍ 收稿日期 接受发表 : ２０１３－０７－２５ꎬ ２０１３－１２－２０ 作者简介 陈林杨 男 硕士研究生 主要从事植物分类 植物微生物与分子系统研究 : (１９８４－) ꎬ ꎬ 、 ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｃｈｅｎｌｉｎｙａｎｇ＠ｍａｉｌｋｉｂａｃｃｎ 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 ３７６ ３６ 所改变 提取更加困难 等 烟草 蕨类植物蜈蚣草 提取难度较大的裸子植物 ꎬ ＤＮＡ (Ｓｔａａｔｓ ꎬ ２０１１)ꎮ ꎬ ꎬ ＤＮＡ 根据所使用组织裂解液的不同 植物基因组 苏铁 云南松 以及被子植物马缨花 川滇蔷薇及瑞香 ꎬ 、 ꎬ 、 狼毒的叶片为实验材料 材料信息及来源见表 其中 提取方法主要有 ꎬ １ꎮ ＤＮＡ ＣＴＡＢ (Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ￣ 川滇蔷薇和瑞香狼毒材料取自干燥的蜡叶标本 十六烷基三甲基溴化铵 法 ꎮ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅꎬ ) 和 表１ ＤＮＡ提取用植物材料 (Ｍｕｒｒａｙ Ｔｈｏｍｐｓｏｎꎬ １９８０)、 ＳＤＳ (Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅ￣ 十二烷基硫酸钠 法 等 Ｔａｂｌｅ１ ＰｌａｎｔｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅꎬ ) (Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ ꎬ 编号 这两种方法都是在裂解细胞的基础上 利 种名 科名 １９８３)ꎮ ꎬ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｆａｍｉｌｙ Ｎｕｍｂｅｒ 用多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性后 蜈蚣草 凤尾蕨科 沉淀于有机相中 且保留含有核酸分子的水相 １ Ｐｔｅｒｉｓｖｉｔｔａｔａ ꎬ ꎬ Ｌ. Ｐｔｅｒｉｄａｃｅａｅ 进而达到分离核酸的目的 孙璐宏等 对 苏铁 苏铁科 ( ꎬ ２０１０)ꎮ ２ Ｃｙｃａｓｒｅｖｏｌｕｔａ 于多糖 多酚 单宁 脂质等次生代谢产物含量 Ｔｈｕｎｂ. Ｃｙｃａｄａｃｅａｅ 、 、 、 云南松 松科 较高的植物 在提取基因组 时通常适当添加 ３ Ｐｉｎｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ ꎬ ＤＮＡ Ｆｒａｎｃｈ. Ｐｉｎａｃｅａｅ 一些抗氧化剂保护 免受醌类物质 二硫化 水稻 禾本科 ＤＮＡ 、 ４ Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ 物 多酚氧化酶等物质的损害 以提高 的质 Ｌ. Ｐｏａｃｅａｅ 、 ꎬ ＤＮＡ 拟南芥 十字花科 量 对于富含蛋白质的物种 常 ５ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ (Ｃｌａｒｋｅꎬ ２００９)ꎻ ꎬ (Ｌ.) Ｈｅｙｎｈ Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ 用氯仿 异戊醇反复抽提来减少蛋白质的污染 上 烟草 茄科 － ꎮ ６ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ 述处理都是 提取过程中 提高其质量的常规 Ｌ. Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ ＤＮＡ ꎬ 川滇蔷薇 蔷薇科 操作 但是在某些针叶植物 多糖或酚类物质含 ７ Ｒｏｓａｓｏｕｌｉｅａｎａ ꎮ 、 Ｃｒｅｐ. Ｒｏｓａｃｅａｅ 量较多的物种以及标本材料中 利用这些常规操 马缨花 杜鹃花科 ꎬ ８ Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎｄｅｌａｖａｙｉ 作也无法获得高质量的 甚至完全无法获得 Ｆｒａｎｃｈ. Ｅｒｉｃａｃｅａｅ ＤＮＡꎬ 瑞香狼毒 瑞香科 的情况也常常出现 由于植物种类繁多 影 ９ Ｓｔｅｌｌｅｒａｃｈａｍａｅｊａｓｍｅ ＤＮＡ ꎮ ꎬ Ｌ. Ｔｈｙｍｅｌａｅａｃｅａｅ 响 质量的物质在不同植物类群中有明显差 ＤＮＡ 别 常规去多糖多酚预处理溶液不能广泛适用于 试剂 裂解液 －１ ꎬ １１２ : １００ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ ５ｍｍｏｌ 某些难以提取的植物种类 如部分杜鹃花科 瑞 －１ －１山梨醇 －１ Ｌ ＥＤＴＡꎬ ３５０ ｍｍｏｌＬ ꎬ ７１０ ｍｍｏｌＬ ＮａＣｌꎬ ꎬ 、 香科 含树脂较多的裸子植物以及长期存放的干 １％ Ｎａ￣Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅꎬ ＣＴＡＢ １％ꎬ ０１ｍｏｌ Ｎａ２ＳＯ３ꎬ ０１％ 、 三 羧乙基 膦盐酸盐 材料等 等 等 (２￣ ) (Ｔｒｉｓ (２￣ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ) ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ (Ｃｓａｉｋｌ ꎬ １９９８ꎻ Ｓｐｅｒｉｓｅｎ ꎬ ２０００ꎻ Ｖａｒ￣ 等 等 有些植物材料虽 ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅꎬ ＴＣＥＰ) ｍａ ꎬ ２００７ꎻ Ｔｅｌｆｅｒ ꎬ ２０１３)ꎮ －１ 经常规 法可以提出 但含杂质较多 ２×ＣＴＡＢ: ２％ ＣＴＡＢꎬ ０１ｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ８０)ꎬ ＣＴＡＢ ＤＮＡꎬ ꎬ －１ －１ １４ｍｏｌＬ ＮａＣｌꎬ ２５ｍｍｏｌＬ ＥＤＴＡꎮ 且可能抑制 反应或影响其他下游实验 ＰＣＲ ꎮ 干扰物清除液: １００ｍｍｏｌＬ－１ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ ５ｍｍｏｌＬ－１ 因此 在总结本实验室 提取经验的基 甘油 三 羧乙基 ꎬ ＤＮＡ ＥＤＴＡꎬ ５％ ꎬ １０％ ＰＥＧ８０００ꎬ ０１％ (２￣ ) 础上 以 种新鲜植物叶片 其中包括常见的 膦 盐酸盐 ꎬ ７ ( (Ｔｒｉｓ (２￣ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ) ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅꎬ 模式植物和困难植物材料 和 种标本叶片为 ) ２ ＴＣＥＰ)ꎮ 材料 在 裂解法和商业 提取试剂盒 溶液 －１ －１ ＴＥ０１ : １ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ ０１ ｍｍｏｌＬ ꎬ ＣＴＡＢ ＤＮＡ 灭菌备用 的基础上 于裂解细胞之前 去除可能产生干扰 ＥＤＴＡꎬ ꎮ ꎬ ꎬ 的代谢物 随后按上述方法提取 并进行了 ７５ｍｏｌＬ－１醋酸铵 ꎬ ＤＮＡ 本实验所用其他化学试剂均为分析纯或以上级别 一些优化 以此阐述这一方法的改良对提高基因 ꎮ ꎬ 分子生物学试剂购自宝生物工程有限公司 大 组 质量和纯度的作用 (ＴａＫａＲａꎬ ＤＮＡ ꎮ 连 引物均由生工生物工程有限公司 上海 合成 )ꎬ ( ) ꎮ １２ 基因组ＤＮＡ提取 １ 材料与方法 本方法基于传统 方法 具体操作步骤如下 ＣＴＡＢ ꎬ : １１ 材料 称取新鲜叶片 干材料 装于 冻存 １. １００ｍｇꎬ ３０ｍｇꎬ ２ｍＬ 实验材料 本研究中用于总 提取的植物材 管中置于液氮中冷冻 加入 石英砂和 水不溶 １１１ ＤＮＡ ꎬ ０１ｇ ５０ｍｇ 料包括三种分子生物学常用的模式植物水稻 拟南芥及 性 聚乙烯聚吡咯烷酮 、 ＰＶＰＰ (Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅꎬ ) 期 陈林杨等 一种改良的植物基因组 通用提取方法 ３ : ＤＮＡ ３ ７７ 磨至粉末状 转移至 离心管中 加入干扰物清 对一致 仅随机选取一个进行电泳 结果显示于 ꎬ ２ｍＬ ꎻ ２. ꎬ ꎬ 除液 震荡 ｇ离心 弃上清 图 中 如图 所示 本方法对所用 种材料 １０００μＬꎬ １ｍｉｎꎬ１２０００ １０ｍｉｎꎬ １ ꎮ １Ｃ ꎬ ９ 液 重复步骤 一到两次直至上清液不粘稠 的 都进行了有效的分离 体现出了良好地 ꎻ ３. (２) ꎻ ４. ＤＮＡ ꎬ 加入 在 预热的裂解液和 ８００μＬ ６５℃ ４μＬ ＲＮａｓｅ Ａ (１０ 对不同材料的适应性 且未出现明显降解或 －１ 充分振荡混匀 水浴中放置 ꎬ ｍｇｍＬ )ꎬ ꎬ ６５ ℃ ６０ ｍｉｎꎬ 残留 经干扰物清除液清洗材料后的试剂 每 振荡 次 取出离心管 ｇ 离心 ＲＮＡ ꎮ ２０ｍｉｎ １ ꎻ ５. ꎬ １２ ０００ １０ 盒方法同样获得了很好的提取效果 说明本方法 取上清 加入等体积的氯仿 异戊醇 ꎬ ｍｉｎꎬ ꎻ ６. ∶ (２４∶１Ｖ/Ｖ) 中第一步对干扰物的去除对于困难植物的 混合液 充分混匀 室温下 ｇ离心 取上清 ＤＮＡ ꎬ ꎬ １２０００ ５ｍｉｎꎬ 提取至关重要 图 试剂盒法无法提取 液ꎻ ７. 重复步骤 (６) １次ꎻ ８. 加入１００μＬ ７５ｍｏｌＬ－１ ( １: Ａ)ꎮ 的醋酸铵和等体积预冷 的异丙醇 充分混匀 川滇蔷薇和瑞香狼毒的 图 常规 (－２０℃) ꎬ ꎬ ＤＮＡ ( １: Ｂ)ꎮ 放置半小时左右 于 下 ｇ离心 法对于不同植物材料提取效果彼此差异也 －２０℃ ꎮ ４℃ １２０００ ５ｍｉｎꎬ ＣＴＡＢ 弃上清 加入 酒精 洗涤一次 ｇ 比较大 无法提取云南松 川滇蔷薇 瑞香狼毒 ꎻ ９. １０００μＬ７５％ ꎬ ꎬ １２０００ ꎬ 、 、 离心 加入 酒精 同前洗涤一次 的 图 常规 法和试剂盒法 １ｍｉｎꎻ １０. １０００μＬ９５％ ꎬ ꎻ ＤＮＡ ( １: Ｄ)ꎮ ＣＴＡＢ 开盖在 下加热 以去除残留乙醇 加 １１. ９０℃ ２ｍｉｎ ꎻ １２. 对于干标本的 提取效果都比较差 本方法 溶液溶解 保存 ＤＮＡ ꎮ ６０μＬ ＴＥ０１ ＤＮＡꎬ －２０℃ ꎮ 所提取出的川滇蔷薇 浓度虽较低 但能够 用常规 法 以及 ＤＮＡ ꎬ ＣＴＡＢ (Ｃｌａｒｋｅꎬ２００９) Ｅ. Ｚ. Ｎ. Ａ. Ｐｌａｎｔ 满足一般下游实验需要 试剂盒法 ꎮ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ￣ｔｅｋ Ｉｎｃ.ꎬ Ｎｏｒｃｒｏｓｓꎬ 分别提取上述材料 经本方法去除干扰物后再使 ＵＳＡ) ꎬ 用 试剂盒作为一种改良的 Ｅ. Ｚ. Ｎ. Ａ. ＰｌａｎｔＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ 试剂盒法作为本方法的参照 具体方法严格按照文献或 ꎬ 试剂盒说明书进行 所有方法均于第一步细胞裂解过程 ꎮ 中添加 去除 每种材料平行提取 份 ＲＮａｓｅＡ ＲＮＡꎮ ３ ꎮ １３ ＤＮＡ质量检测 琼脂糖凝胶电泳检测 取 已溶解的 样 １３１ ５μＬ ＤＮＡ 品 加入 上样缓冲液 用 的琼脂糖凝胶电 ꎬ ２μＬ ６× ꎬ １％ 泳进行检测 并以 为参照 ꎬ ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ (ＴａＫａＲａ) ꎮ 电泳 后 于紫外凝胶成像系统 １１０Ｖ ３０ｍｉｎ ꎬ (Ｔａｎｏｎ４１００ꎬ 上海天能科技有限公司 上海 下观察并照相 ꎬ ) ꎮ 紫外分光光度计检测 取 样品 用 １３２ ２ μＬ ＤＮＡ ꎬ 分光光度计 Ｎａｎｏｄｒｏｐ (ＮＤ￣１０００ꎬ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ￣ 检测 的浓度和纯度 值 ｉｃꎬ ＵＳＡ) ＤＮＡ (Ａ２６０/２８０ )ꎮ 扩增 分别以上述 种方法所提取的 １３３ ＰＣＲ ４ ＤＮＡ 图 琼脂糖凝胶电泳检测结果 为模板 用通用引物 ｔｒｎ 等 进行 １ ＤＮＡ ꎬ Ｌ￣Ｆ (Ｔａｂｅｒｌｅｔ ꎬ １９９１) 经过干扰物去除后试剂盒法 常规试剂盒法 本方法 扩增 以检测所提取 中是否有抑制 成分 Ａ. ꎻＢ. ꎻＣ. ꎻ ＰＣＲ ꎬ ＤＮＡ ＰＣＲ 常规 法 样品编号及名称同表 为 Ｄ. ＣＴＡＢ ꎮ Ｍ ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎬ 存在 反应体系如下 ꎮ ２０ μＬ : １０ μＬ ２ｘ ＥｘＴａｑ ｐｒｅｍｉｘ 片段大小分别为 ２０００ｂｐꎬ １０００ｂｐꎬ ７５０ｂｐꎬ ５００ｂｐꎬ ２５０ｂｐꎬ (ＴａＫａＲａꎬ 大连)ꎬ 正反向引物各１μＬ (１０μｍｏｌＬ－１)ꎬ 提 从上至下 １００ｂｐ ( ) 取出的 各 作为模板 用去离子水补至 ＤＮＡ １０ｎｇ ꎬ ２０μＬꎮ Ｆｉｇ１ ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 扩增于伯乐公司 型 仪中进行 ＰＴＣ￣２００ ＰＣＲ (Ｂｉｏ￣Ｒａｄꎬ ｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ 程序为 预变性 变性 ＵＳＡ)ꎬ : ９４℃ ４ｍｉｎꎻ ９４℃ １ｍｉｎꎬ Ａ. ｍｏｄｉｆｉｅｄｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｂ. ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｃ. ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｄ. ｒｅｇｕｌａｒ 退火 延伸 个循环 延伸 ５６℃ １ｍｉｎꎬ ７２℃ １ｍｉｎꎬ ３３ ꎻ ７２℃ ＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ.ＭｉｓＤＮＡＭａｒｋｅｒꎬｔｈｅｓｉｚｅｉｓ２０００ｂｐꎬ１０００ｂｐꎬ７５０ｂｐꎬ 扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳检测 凝胶成 １０ｍｉｎꎮ １５％ ꎬ ５００ｂｐꎬ２５０ｂｐａｎｄ１００ｂｐꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ(ｆｒｏｍｔｏｐｔｏｂｏｔｔｏｍ) 像系统下观察并照相 ꎮ ２２ ＤＮＡ的浓度及纯度测定———紫外分光光度法 ２ 结果 如表 所示 所用各个材料经本方法提取的 ２ ꎬ ２１ ＤＮＡ电泳检测 浓度和纯度均较好 且较为均一 常规 ＤＮＡ ꎬ ꎮ 由于每个种 个平行样的 提取结果相 法对有些材料虽然提取出的 浓度较 ３ ＤＮＡ ＣＴＡＢ ＤＮＡ 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 ３７８ ３６ 高 但不同材料提取效果差异较大 比如提取出 ꎬ ꎬ 的瑞香狼毒及川滇蔷薇 成凝胶状 无法使 ＤＮＡ ꎬ 用 仪的进行浓度和纯度测定 与 Ｎａｎｏｄｒｏｐ ꎮ Ａ２６０ 比值是检测 纯度的指标 高纯度的 Ａ２８０ ＤＮＡ ꎬ 样品 值应在 之间 ＤＮＡ Ａ２６０/２８０ １８~２０ ꎬ Ａ２６０/２８０ 值大于 时 说明 样品中 含量过 ２０ ꎬ ＤＮＡ ＲＮＡ 高 值小于 时 说明 样品中可 ꎻ Ａ２６０/２８０ １８ ꎬ ＤＮＡ 能存在蛋白质污染 几种方法中 常规 法 ꎮ ꎬ ＣＴＡＢ 提取出的 质量最差 且变异系数最大 经 ＤＮＡ ꎬ ꎮ 过干扰物清除液清洗后的试剂盒法整体浓度偏 低 所提取的 值均处于 与 ꎬ ＤＮＡ Ａ２６０/２８０ １８ ２０ 之间 且变异系数最小 较为均一 对于相对难 ꎬ ꎬ ꎮ 提取的材料如马缨花 川滇蔷薇及瑞香狼毒 本 、 ꎬ 方法所提取的 总体质量较好 浓度高 重 ＤＮＡ ꎬ ꎬ 图 不同方法提取的 扩增效果比较 复性也较好 ２ ＤＮＡＰＣＲ ꎮ 改良试剂盒法 试剂盒法 本方法 常规 法 ２３ ＰＣＲ扩增结果 Ａ. ꎻＢ. ꎻＣ. ꎻＤ. ＣＴＡＢ ꎮ 为 片段大小分别为 Ｍ ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎬ ２０００ｂｐꎬ １０００ｂｐꎬ 以上述 种方法所提取的 为模板 以 从上至下 图中编号 ４ ＤＮＡ ꎬ ７５０ｂｐꎬ ５００ｂｐꎬ ２５０ｂｐꎬ １００ｂｐ ( )ꎬ １~７ 通用引物 ｔｒｎ 进行 扩增 结果见图 所代表的物种与表 中的所示相同 Ｌ￣Ｆ ＰＣＲ ꎬ ２ꎮ １ 结果显示 以干扰物清除液清洗后的方法所提取 Ｆｉｇ２ ＰＣＲＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＤＮＡｓａｍｐｌｅｓ ꎬ 的 为模板进行 扩增 成功率高 图 ｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ ＤＮＡ ＰＣＲ ꎬ ( ２: 可以获得条带单一的扩增条带 而用传 Ａ. ｍｏｄｉｆｉｅｄＫｉｔｍｅｔｈｏｄꎻＢ. ＫｉｔｍｅｔｈｏｄꎻＣ. ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄꎻＤ. ｒｅｇｕｌａｒ Ａꎬ Ｃ)ꎬ ꎻ ＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ.ＭｉｓＤＮＡＭａｒｋｅｒꎬｔｈｅｓｉｚｅｉｓ２０００ｂｐꎬ１０００ｂｐꎬ７５０ｂｐꎬ 统方法提取的 作为模板时 对于某些物种 ＤＮＡ ꎬ ５００ｂｐꎬ２５０ｂｐａｎｄ１００ｂｐꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ(ｆｒｏｍｔｏｐｔｏｂｏｔｔｏｍ). 图 中的 号 号 号及 号 无法获 ( ２: Ｄ １ 、 ３ 、 ７ ９ ) Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒ１－７ａｒｅｓａｍｅａｓＴａｂｌｅ１ 表２ 不同方法提取ＤＮＡ浓度及纯度比较 Ｔａｂｌｅ２ ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｔｙｏｆＤＮＡｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ 本方法 法 试剂盒法 改良后试剂盒法 ＣＴＡＢ 编号 Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ ＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ Ｋｉｔｍｅｔｈｏｄ ＭｏｄｉｆｉｅｄＫｉｔｍｅｔｈｏｄ 浓度 浓度 浓度 浓度 Ｎｕｍｂｅｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａ２６０/２８０ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａ２６０/２８０ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａ２６０/２８０ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａ２６０/２８０ －１ －１ －１ －１ /ｎｇｕｌ /ｎｇｕｌ /ｎｇｕｌ /ｎｇｕｌ １ ２０６７ １９５ ７２１８ １９８ ８９５ １９３ ５３６ １９５ ２ １１１９１ ２０ ２７６２２ １９３ １２９８ １９２ ２３４４ １９０ ３ ５９４７ １９２ ９７１ １７９ １２５７ １７９ ２９６８ １９１ ４ ５６９４ １８７ ２０４７３ ２０８ １５５７ １８１ １３３６ １９０ ５ １１３ １８ ６７９ １９２ ２９６ １８５ ６０８ １９３ ６ １２１１１ １８９ ９３６８ １５３ １５８８ １８６ ４１１３ １８８ ７ ２６７９ １８５ ＮＡ ＮＡ ＮＡ ＮＡ ９１７ １８７ ８ １９８６ １９４ ９９７ １７３ ５８２ １３６ ４８３ １７９ ９ ４２２８ １７５ ＮＡ ＮＡ ５９９ １５６ ２７８０ １９０ Ｍｅａｎ ５２２６ １８９ ８４１６ １６２ ８９７ １５６ １７８７ １８９ ＳＤ ４００７２ ００８ １０４０４３ ０６８ ５６５４ ０６２ １３０９４ ００５ ＣＶ ０７７ ００４ １２４ ０４２ ０６３ ０３９ ０７３ ００２ ＳＤ 标准差 ＣＶ 变异系数 无法检测获得 : ꎬＳｔａｎｄａｒｄＤｅｖｉａｔｉｏｎꎻ : ꎬ ＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆＶａｒｉａｔｉｏｎꎻ ＮＡ: ꎬ ＮｏｔＡｖａｉｌａｂｌｅ 表中浓度及纯度值均为三个重复样品的平均值 ＡｌｌＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｔｙｄａｔａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｈｅａｖｅｒａｇｅｖａｌｕｅｆｒｏｍｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ 期 陈林杨等 一种改良的植物基因组 通用提取方法 ３ : ＤＮＡ ３ ７９ 得目的条带 但是经过干扰物清除液清洗后成功 实验中替代 巯基乙醇和二硫苏糖醇使用 同 ꎬ β￣ ꎮ 获得了单一的条带 图 经过干扰物清除 时采用更易获得的甘油代替原配方中的山梨醇 ( ２: Ｃ)ꎮ ꎬ 液清洗后 再用 法或者试剂盒继续提取 效果相同 未发表数据 鉴于已有文献报道尤 ꎬ ＣＴＡＢ ( )ꎮ 后进行目的基因的 扩增都能获得单一条 其是对于时间较长且已发生 降解的材料 亚 ＤＮＡ ＰＣＲ ＤＮＡ ꎬ 带 图 由此说明 本方法能够有效 硫酸钠可以有效改善所提取 的完整性 本实 ( ２: Ａꎬ Ｃ)ꎮ ꎬ ＤＮＡ ꎮ 减少所提取 中残留的 反应抑制成分 验室一般会在对此类材料 提取的干扰物清 ＤＮＡ ＰＣＲ ꎮ ＤＮＡ ２４ 干扰物清除液对所提取ＤＮＡ中杂质的清除 除液中添加原配方中没有的亚硫酸钠 (Ｂｙｒｎｅ 在 提取过程中 富含酚类等次生代谢 等 等 但其对植物材料 ＤＮＡ ꎬ ꎬ ２００１ꎻ Ｂａｒａｎｗａｌ ꎬ ２００３)ꎮ 物植物材料 其 被乙醇沉淀后可能被酚类 的实际效果需要进行严格的比对实验证明 本实 ꎬ ＤＮＡ ꎮ 氧化成棕褐色 等 本研究中 验室尚未发现亚硫酸钠对于常规新鲜植物材料 (Ｍａｌｔａｓ ꎬ ２０１１)ꎮ ꎬ 瑞香狼毒即是如此 而经过本方法去除干扰杂质 提取有任何不良效果 因此在本文干扰物 ꎮ ＤＮＡ ꎬ 后 瑞香狼毒 溶液呈无色透明 由此显示 清除液配方中未明确列出 未发表数据 本方 ꎬ ＤＮＡ ꎬ ( )ꎮ 其中杂质被较彻底地去除 用干扰物清除液洗涤 法还提高了去除干扰物缓冲液原配方中 ꎮ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ 材料后能有效去除此类次生代谢物 提取的 的浓度 以适于更广泛的植物材料 ꎬ ＤＮＡ ꎬ ꎮ 近无色 图 从文中可以看出 本方法中的干扰物清除尤 ( ３)ꎮ ꎬ 为重要 是本方法具有广泛适用性的关键 可以 ꎬ ꎬ ３ 讨论 在提取起始时去除干扰物 却不会造成 产 ꎬ ＤＮＡ 本方法基于传统 法和 等 率的显著下降 当然对于拟南芥之类较易提取的 ＣＴＡＢ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ꎮ 对于木本植物 的提取方法 但作 材料 无需这一过程 本方法较为灵活 同时适 (１９９８) ＤＮＡ ꎬ ꎬ ꎮ ꎬ 了一定的改进 如 于组织裂解水浴加热期 用于新鲜材料 冷冻材料或长期保存的干标本材 ꎬ : １. 、 间添加 有效去除了其中的 而且 料 本方法可以不使用试剂盒进行 所有试剂都 ＲＮａｓｅ Ａꎬ ＲＮＡꎬ ꎮ ꎬ 所添加的 会随后续纯化过程一并去除 可以很容易地获得 配制过程简单 较为经济 ＲＮａｓｅ Ａ ꎮ ꎬ ꎬ ꎬ 简化了步骤 同时减少了 损失 本方法 仅需一台常规台式离心机即可 而对于下游实验 ꎬ ＤＮＡ ꎻ ２. ꎮ 将原始文献中干扰物清除液中的 巯基乙醇替 要求起始 质量较高时 我们推荐本方法结 β￣ ＤＮＡ ꎬ 换成 该试剂还原力强 不仅没有刺激性 合 吸附柱或试剂盒使用 如本文中的改良 ＴＣＥＰꎮ ꎬ ＤＮＡ ꎬ 气味 并且能在室温下保存 目前逐渐在生物学 试剂盒法 这也是本实验室更多使用的方法 不 ꎬ ꎮ ꎮ ꎮ 图 不同提取法下瑞香狼毒和烟草的 色泽比较 瑞香狼毒 烟草 常规 法 本方法 ３ ＤＮＡ ꎮ Ａ. ꎻＢ. ꎮ １. ＣＴＡＢ ꎻ２. Ｓ ｃｈａｍａｅｊａｓｍｅ Ｎ ｔｏｂａｃｕｍ Ｆｉｇ３ ＴｈｅｐｈｏｔｏｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｅｄＤＮＡｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓ. Ａ: ꎻＢ. .１. ｒｅｇｕｌａｒＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄꎻ２. ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ 植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷 ３８０ ３６ 同植物类群中次生代谢物的组成不同是造成其 ｅｔａｌ ＣｓａｉｋｌＵＭꎬＢａｓｔｉａｎＨꎬＢｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒＲ .ꎬ１９９８.Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａ￣ 提取差异的重要原因 等 ｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ: Ａ ｆａｓｔꎬ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＮＡ (Ｖａｒｍａ ꎬ ２００７)ꎮ 而一般认为 同一类群的植物其次生代谢物组成 ｍａｘｉ￣ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｐｌａｎｔＤＮＡｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ꎬ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ 有一定共性 在本方法中 我 ａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓ [Ｊ]. ꎬ (Ｈｅｇｎａｕｅｒꎬ１９８６)ꎮ ꎬ １６ :６９—８６ 们选择了包括蕨类植物 裸子植物 双子叶植 、 、 ＤｅｌｌａｐｏｒｔａＳＬꎬＷｏｏｄ Ｊꎬ Ｈｉｃｋｓ ＪＢꎬ １９８３. Ａ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａ￣ 物 单子叶植物的共计 种植物 分属于 个不 ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ １ 、 ９ ꎬ ９ ｔｉｏｎ:ＶｅｒｓｉｏｎⅡ[Ｊ]. ꎬ :１９—２１ 同的科 尤其包含了本实验室在实际研究中遇到 ＨｅｇｎａｕｅｒＲꎬ１９８６. Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｐｌａｎｔｔａｘｏｎｏｍｙ—ａｎ ｅｓｓａｙｏｎ ꎮ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５ 的提取较为困难的植物种类 如杜鹃花科的马缨 ｔｈｅｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ [Ｊ]. ꎬ : ꎬ 花 蔷薇科的川滇蔷薇和瑞香科的狼毒 对这些 １５１９—１５３５ 、 ꎮ ｅｔａｌ ＫｏｂａｙａｓｈｉＮꎬＨｏｒｉｋｏｓｈｉＴꎬＫａｔｓｕｙａｍａＨ .ꎬ １９９８.Ａｓｉｍｐｌｅａｎｄ 系统位置差异较大的植物材料 本方法均可以有 ꎬ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｌａｎｔｓꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｗｏｏｄｙ 效提取 并用于下游研究 因此有一定的通 ＰｌａｎｔｔｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ ４ ＤＮＡ ꎬ ｐｌａｎｔｓ [Ｊ]. ꎬ :７２—８０ 用性 而在实际工作中 该方法作为本实验室针 李金璐 王硕 于婧 ｅｔ ａｌ ＬｉＪＬ( )ꎬＷａｎｇ Ｓ ( )ꎬ Ｙｕ Ｊ ( ) .ꎬ ２０１３. Ａ ꎮ ꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ 对困难植物材料 提取的标准方法 已被用于 ｍｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ [Ｊ]. ＤＮＡ ꎬ ＢｕｌｌｅｔｉｎｏｆＢｏｔａｎｙ 植物学报 ４８ 数十种不同科属植物的 的提取 并为周边实 ( )ꎬ :７２—７８ ＤＮＡ ꎬ ＭａｌｔａｓＥꎬ Ｖｕｒａｌ ＨＣꎬ ＹＩＬＤＩＺ Ｓ. ２０１１. Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 验室所采用 限于文章篇幅 不一一敷述 Ｊｏｕｒ￣ ꎮ ꎬ ꎮ ｆｒｏｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ￣ａｎｄｐｈｅｎｏｌｉｃｓ￣ｒｉｃｈＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａ [Ｊ]. 综上所述 我们认为本方法是一种通用的植 ｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｌａｎｔｓＲｅｓｅａｒｃｈ ５ ꎬ ꎬ :３３２—３３９ 物 提取方法 尤其适于困难植物材料 干 ｅｔａｌ ＤＮＡ ꎬ 、 ＭｕｈａｍｍａｄＩꎬＺｈａｎｇＴＴꎬＷａｎｇＹ .ꎬ２０１３.ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＴＡＢ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｒ￣ 标本材料等 值得推广使用 ｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｍａｉｚｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ [Ｊ]. ꎬ ꎮ ｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８ ꎬ :４１—４５ 致谢 云南省农科院蹇红英博士提供川滇蔷薇 云南师 ＭｕｒｒａｙＨＧꎬＴｈｏｍｐｓｏｎＷＦꎬ１９８０. Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ꎬ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ８ ｗｅｉｇｈｔＤＮＡ [Ｊ]. ꎬ :４３２１—４３２５ 范大学的张永洪老师提供瑞香狼毒材料 中科院昆明植 ꎬ ＳａｈｕＳＫꎬＴｈａｎｇａｒａｊＭꎬＫａｔｈｉｒｅｓａｎＫꎬ２０１２.ＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌ 物研究所胡向阳老师提供拟南芥材料 昆明植物园提供 ꎬ ｆｏｒｐｌａｎｔｗｉｔｈｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｓａｃ￣ 马缨花材料 ＩＳＲＮ ꎮ ｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｌ [Ｊ]. ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ２０５０４９ ꎬ 〔参 考 文 献〕 ｅｔ ａｌ ＳｐｅｒｉｓｅｎＣꎬ Ｇｕｇｅｒｌｉ Ｆꎬ Ｂüｃｈｌｅｒ Ｕ .ꎬ ２０００. Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｒａｐｉｄＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍｓｆｏｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ ＦｏｒｅｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ ＡｍａｉｎｉＪꎬＫａｚｅｍｉ Ｒꎬ Ａｂｂａｓｉ ＡＲ .ꎬ ２０１１. Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓ [Ｊ]. ꎬ ７ ｌｅａｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ￣ :１３３—１３６ ＩｒａｎｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９ ｅｔ ａｌ ｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ [Ｊ]. ꎬ :６９—７１ ＳｔａａｔｓＭꎬ Ｃｕｅｎｃａ Ａꎬ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＪＥ .ꎬ ２０１１. ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｅｔａｌ ＰｌｏＳＯＮＥ ６ Ｂａｒａｎｗａｌ ＶＫꎬＭａｊｕｍｄｅＳꎬＡｈｌａｗａｔＹＳ .ꎬ２００３.Ｓｏｄｉｕｍｓｕｌｐｈｉｔｅ ｐｌａｎｔｈｅｒｂａｒｉｕｍｔｉｓｓｕｅ [Ｊ]. ꎬ :ｅ２８４４８ 孙璐宏 鲁周民 张丽 ｙｉｅｌｄｓｉｍｐｒｏｖｅｄＤＮＡｏｆｈｉｇｈｅｒｓｔａｂｉｌｉｔｙｆｏｒＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｉｔ￣ ＳｕｎＬＨ( )ꎬＬｕＺＭ( )ꎬＺｈａｎｇＬ( )ꎬ２０１０.Ａｄ￣ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏ￣ ｒｕｓｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｆｒｏｍ ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｖｅｓ [Ｊ]. ｖａｎｃｅｓｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ [Ｊ]. ｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ １１２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 西北林学院学报 ꎬ :１５３—１５６ ( )ꎬ ｅｔ ａｌ ２５ ＢａｒｚｅｇａｒｉＡꎬＶａｈｅｄＳＺꎬ Ａｔａｓｈｐａｚ Ｓ .ꎬ２０１０. Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ :１０２—１０６ ｅｔ ａｌ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍｃｏｎｉｆ￣ ＴａｂｅｒｌｅｔＰꎬ Ｇｉｅｌｌｙ Ｌꎬ Ｐａｕｔｏｕ Ｇ .ꎬ １９９１. Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ Ｔａｘｕｓｂａｃｃａｔａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｅｒｏｕｓｔｉｓｓｕｅｓ( ) [Ｊ]. ꎬ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ＤＮＡ ３７ ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ １７ :８３３—８３７ [Ｊ]. ꎬ :１１０５—１１０９ ｅｔａｌ ＢｙｒｎｅＭꎬ Ｍａｃｄｏｎａｌｄ Ｂꎬ Ｆｒａｎｃｋｉ Ｍꎬ ２００１. Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ＴｅｌｆｅｒＥꎬＧｒａｈａｍＮꎬＳｔａｎｂｒａＬ .ꎬ２０１３.Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙ ｓｕｌｆｉｔｅ ｉｎｔｏ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｍｉｎｉｍｉｚｅｓ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃａｃｉａ ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍ ｐｉｎｅ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ａ ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３０ ＮｅｗＺｅａｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ ４３ ＤＮＡ [Ｊ]. ꎬ :７４２—７４８ Ｐｌａｔｆｏｒｍ [Ｊ]. ꎬ :３ ＣｌａｒｋｅＪＤꎬ２００９. Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ (ＣＴＡＢ) ＤＮＡ ＶａｒｍａＡꎬＰａｄｈＨꎬＳｈｒｉｖａｓｔａｖａ Ｎꎬ２００７. Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｉｓｏｌａ￣ ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｏｔｏ￣ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ ２ ｍｉｎｉｐｒｅｐｆｏｒｐｌａｎｔＤＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎ [Ｊ]. ｔｉｏｎ:Ａｎａｒｔｏｒａｓｃｉｅｎｃｅ [Ｊ]. ꎬ :３８６— ｃｏｌｓ ꎬｄｏｉ:１０１１０１/ｐｄｂｐｒｏｔ５１７７ ３９２
The list of books you might like
