Table Of Content

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ УДК 004.067 ББК 32.973.26-018.2 Московская государственная академия M31 тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова Рецензенты: к.х.н., доц. Чудинов М.В.,. (кафедра биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова) к.х.н., с.н.с. Тоукач Ф.В.,. (ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН) Маслов М.А., Нечаев А.В., Кафедра химии и технологии Информационные технологии биологически активных соединений Учебно-методическое пособие им. Н.А. Преображенского М., МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 2007 Утверждено Библиотечно-издательской комиссией МИТХТ им. М.В. Ломоносова в качестве М.А. Маслов, А.В. Нечаев учебного пособия. Поз. № 242/2007. В данном учебном пособии освещены приемы работы со спектрами ЯМР в программе Обработка спектров ЯМР в программе 1D Win-NMR 1D Win-NMR. Даны основные операции, показаны способы интегрирования спектров в другие электронные документы. Учебное пособие дополняет учебники и учебные пособия по курсу «Информационные технологии» и предназначено для студентов дневного и вечернего отделений, обучающихся по специальности 070100 «Биотехнология». Учебное пособие будет полезным для студентов 4-6 курсов дневного и вечернего отделений в рамках выполнения Учебное пособие квалификационных работ бакалавров, дипломов специалистов и магистерских диссертаций по программе 550800 «Химия и технология биологически активных веществ», а также аспирантов, специализирующихся в области органической и биоорганической химии. МОСКВА 2007 © МИТХТ им. М. В. Ломоносова, 2007 СОДЕРЖАНИЕ 1. Введение 1. Введение...........................................................................................................................3 2. Программа 1D Win-NMR...............................................................................................4 Спектроскопия ЯМР высокого разрешения является эффективным аналитическим 2.1. Введение........................................................................................................4 инструментом для решения структурных и динамических задач современной органической, физической и биологической химии. Различные аспекты применения 2.2. Временное и частотное представление данных ЯМР................................5 ядерного магнитного резонанса обеспечиваются большим количеством 2.3. Окно Spectrum (Спектр) программы 1D Win-NMR.......................................5 экспериментальных методик, что ставит спектроскопию ЯМР в особое положение по 2.3.1. Загрузка файлов.......................................................................................6 сравнению с другими спектральными методами. Сигналы ЯМР отражают влияние 2.3.2. Операции с данными ССИ. Меню Process (Обработка)........................6 целого ряда слабых взаимодействий между ядрами и электронами внутри 2.3.2.1. Увеличение чувствительности и разрешения спектра.....................7 молекулы, между различными ядрами одной молекулы и между ядрами соседних 2.3.2.2. Преобразование Фурье (FT)...............................................................8 молекул, то есть параметры спектра ЯМР (химические сдвиги и константы спин- 2.3.3. Операции со спектром 1H-ЯМР. Меню Process (Обработка)................9 спинового взаимодействия) напрямую связаны электронной структурой и 2.3.3.2. Коррекция базовой линии спектра (Baseline Correction)................11 топологией молекулы. 2.3.4. Операции со спектром 1H-ЯМР. Меню Analysis...................................14 Физические основы спектроскопии ЯМР определяются магнитными свойствами 2.3.4.1. Калибровка спектра (Calibration)......................................................14 атомных ядер с ненулевыми ядерными магнитными моментами (протон 1Н, изотопы 2.3.4.2. Интегрирование спектра (Integration)..............................................14 азота 14N и 15N, углерода 13С и др.). Применение ЯМР для определения структуры 2.3.4.3. Проставление значений химических сдвигов (Peak Picking).........16 неизвестных веществ или подтверждения структуры соединений, полученных в ходе 2.4. Окно Preview (Предварительный просмотр) программы Win-NMR.........17 химических превращений, основано на эмпирически найденных корреляциях между 2.4.1. Изменение графического представления спектра...............................17 спектральными параметрами и строением вещества. В этом отношении ядерный магнитный момент оказался очень чувствительным зондом, с помощью которого 2.4.2. Вынесение отдельной области спектра...............................................18 можно получить обширную информацию. По значению химического сдвига можно 2.4.3. Печать спектра.......................................................................................19 судить о химическом окружении ядра, а интегрирование спектра позволяет сделать 2.4.4. Сохранение графического представления спектра в метафайл........19 выводы об относительном количестве присутствующих ядер. Спин-спиновое 2.4.5. Импорт спектра в приложения Microsoft Office.....................................20 взаимодействие дает возможность определить положение ядер относительно друг 3. Дополнительные главы..........................................................................................20 друга. 3.1. Операции со спектром ЯМР. Меню Output (Выходные данные)..............20 Для получения информации о структуре соединения требуется использовать все 3.2. «Стыковка» нескольких спектров...............................................................21 параметры спектра ЯМР, а именно: химический сдвиг и вид сигнала ЯМР; константы 3.3. Операции со спектром ЯМР. Меню Display (Отображение).....................22 спин-спинового взаимодействия (КССВ); соотношение интенсивностей компонент ЛИТЕРАТУРА......................................................................................................................23 мультиплета; интегральная интенсивность сигналов. Запись одномерных спектров ПРИЛОЖЕНИЕ....................................................................................................................24 ЯМР в настоящее время является рутинной операцией, в результате которой пользователь получает на руки распечатанный спектр. Однако, как показывает практика, современный химик-исследователь должен уметь оперировать не только с «бумажным», но и с электронным представлением спектра ЯМР, чтобы иметь возможность в любой момент 1) определить или уточнить мультиплетность, химические сдвиги и КССВ сигналов, 2) более детально рассмотреть определенную 3 область спектра, 3) увеличить отношение сигнал/шум и видимое разрешение спектра, 4) включить спектр или его фрагмент в другие электронные документы (отчет, статью, диссертацию, доклад, постер). Цель данного пособия - показать Главное меню основные приемы работы со спектральными данными, полученными в ходе эксперимента по ядерному магнитному резонансу, с использованием программы 1D Рабочее поле Панель Win-NMR, что позволит пользователю уверенно оперировать электронными инструментов данными, а возможет и подтолкнет к более глубокому изучению спектроскопии ЯМР. Программа 1D Win-NMR является простым и удобным инструментов позволяющая студентам приобрести базовые навыки обработки спектральных данных, которые могут быть использованы и при работе с другими программами. Полосы прокрутки 2. Программа 1D Win-NMR 2.1. Введение Программа 1D Win-NMR (рис.1) разработана фирмой Bruker (www.bruker.com) и предназначена для обработки одномерных спектров ЯМР на персональных Рис.1. Окно программы 1D Win-NMR. компьютерах в среде MS Windows. Программа использует данные, полученные со Окно Spectrum используется для отображения, преобразования и анализа спектрометров Bruker, а также других фирм (через программу переноса данных спектральных данных и представляет собой главное рабочее окно программы Win- ЯМР Getfile), и позволяет работать непосредственно с файлами, сохраненными на NMR. Окно Preview дает возможность пользователю подготавливать и персональном компьютере. редактировать обработанные спектральные данные с использованием встроенного Особенностью программы 1D Win-NMR является спецификация MDI (Multiple графического редактора и затем выводить их на печать или сохранять в виде Document Interface), которая предусматривает работу с данными в четырех окнах, со следующими названиями: Spectrum (спектр), Preview (предварительный просмотр), метафайла для дальнейшей интеграции в приложения MS Office или сторонние Relaxation (релаксация) и Text (текст). С одной стороны, эти окна существуют графические редакторы. внутри одной программы, но в то же время независимы друг от друга; их можно Окно Relaxation обеспечивает специальную активировать, изменять в размерах, каждое из них имеет свою организацию меню и среду для обработки экспериментов по подменю. С другой стороны, все эти действия можно проводить только для одного релаксации. Окно Text является простейшим набора данных, полученных в ходе одного эксперимента ЯМР. текстовым редактором для коррекции текстовых данных или отчетов, генерируемых программой Win-NMR. Каждому MDI-окну соответствует своя панель инструментов и свое главное меню. Переход между MDI-окнами осуществляется через меню Window. 4 2.2. Временное и частотное представление данных ЯМР Кнопки для работы с отображением спектра в рабочем окне Сигнал спада свободной индукции (ССИ) является «исходным материалом», Увеличение масштаба по оси Y в 2 раза получаемым непосредственно с ЯМР-спектрометра как отклик образца на Уменьшение масштаба по оси Y в 2 раза радиочастотный импульс. Амплитуда свободной индукции экспоненциально спадает и затухает во времени, то есть ССИ представляет собой изменение амплитуды Растягивание спектра по оси Х в 2 раза сигнала во времени (временное представление спектра ЯМР). Сужение спектра по оси Х в 2 раза Преобразование Фурье (рис. 2) позволяет переходить от временного Вывод полного отображения спектра на экран представления к частотному, в котором амплитуда сигнала зависит от частоты. Возврат к предыдущему отображению спектра Кнопки для выбора различных типов курсоров Увеличение определенной области спектра Выбор зоны увеличения происходит следующим образом: • Активируем кнопку и перемещаем курсор в рабочее поле. • Нажимаем на левую клавишу мыши, при этом фиксируется верхний левый Рис.2. Преобразование временного спектра в частотный. угол масштабируемой области. Перед тем как проводить преобразование Фурье, с временным представлением • Перемещаем курсор вниз вправо для выбора необходимой области данных можно провести ряд операций (увеличение чувствительности и разрешения (выделение прямоугольником) и нажимаем на левую клавишу еще раз, чтобы спектра, см. главу 2.3.2.1.), поэтому важным моментом является приобретение зафиксировать правый нижний угол. При этом указатель мыши переключается основных навыков работы с сигналом ССИ. обратно в верхний левый угол, что позволяет, если это необходимо, скорректировать расположение левой границы. Последующие нажатия левой 2.3. Окно Spectrum (Спектр) программы 1D Win-NMR клавишей мыши переключают курсор между этими двумя положениями. В данном окне проводятся все операции над данными ССИ, его трансформация • Операция масштабирования завершается нажатием на правую клавишу, в частотный спектр, последующий анализ и редактирование. после чего на рабочее поле выводится выбранный фрагмент спектра. Окно Spectrum состоит из главного меню, панели инструментов и рабочего поля. Операция масштабирования может быть прервана единовременным нажатием Кнопки быстрого доступа панели инструментов можно разбить на две группы – на левую и правую клавиши мыши или при использовании комбинации клавиш постоянную и переменную. В постоянной группе набор инструментов не меняется Shift+Esc клавиатуры. при выборе того или иного пункта меню, тогда как в переменной набор команд Курсор на вершине сигнала (Maximum Mode) изменяется в зависимости от операции. Кнопка для расположения курсора на вершине спектрального сигнала. При Постоянные кнопки панели инструментов, приведенные ниже, становятся активации данной кнопки курсор размещается на вершине ближайшего доступны по нажатию на левую клавишу мыши (щелчок). пика слева от места нажатия мышкой в рабочем поле. Курсор на спектре (Perpendicular Mode) 5 Размещает курсор в любой точке спектра. С использованием этой опции Для загрузки спектра ССИ воспользуемся меню File–Open (Alt+F+O), которое также может быть увеличен масштаб спектра по оси X. Для этого запускает типовое диалоговое окно выбора файлов, существующих на жестком или необходимо: 1) выставить указатель на левой границе масштабируемого переносном дисках персонального компьютера. Выберем файл, который содержит участка, 2) нажать на правую клавишу мыши, которая определяет границу информацию о ССИ нашего образца, полученную непосредственно со участка (на спектре появляется вертикальная линия); 3) переместить спектрометра, и подтвердим наш выбор нажатием на клавишу Ok (рис.3). После указатель к правой границе интервала и нажать на правую клавишу мыши, этого в рабочем поле программы появится отображение спектра ССИ, а в главном после чего интересующий нас участок спектра заполнит рабочее окно. меню станет доступен пункт Process (Обработка), отражающий набор математических операций над ССИ. Кнопки изменения типа отображения спектра Инициирует режим раздельных окон Показывает точки с некорректными данными Размещает сетку в рабочей области Переключение между действительной и мнимой частями спектра Изменение единиц измерения по оси Х Также на панели инструментов представлены кнопки, которые запускают выполнение программ фазовой коррекции (Phase Corr. !), интегрирования (Integration !) и др. в автоматическом режиме с применением простейших Рис.3. Загрузка спектра. параметров, установленных в программе по умолчанию. Однако выполнение этих операций не всегда приводит к удачной обработке спектров, поэтому данными 2.3.2. Операции с данными ССИ. Меню Process (Обработка) командами лучше не пользоваться. После загрузки данных о ССИ 2.3.1. Загрузка файлов (рис.4) первой операцией, При запуске программы Win-NMR (рис.1) из семи пунктов главного меню которую всегда необходимо ! доступны лишь три: меню работы с файлами – File, меню работы с программами выполнять, является коррекция симуляции спектров – Simulation (требует установки дополнительного смещения ССИ, которая программного обеспечения) и меню Window для выбора и организации MDI-окон. осуществляется с помощью Остальные пункты главного меню становится активными после загрузки ССИ. Вход меню Process–DC Correction в главное меню осуществляется с помощью нажатия клавиши Alt, или (Alt+P+D). Alt+подчеркнутая буква нужного пункта, или с помощью мыши. В двух последних случаях выбранный пункт меню разворачивается в соответствующее всплывающее меню. 6 Чтобы умножить ССИ на экспоненциальную функцию, надо выбрать опцию Exponential (LB > 0) и установить значение: LB = 0.1 – 0.7 Hz для 1Н-ЯМР спектра LB = 1.0 – 4.0 Hz для 13C-ЯМР спектра. Для выполнения операции над спектром используется команда Execute (Выполнить). Следует отметить, что в случае спектра 1Н-ЯМР, данная операция приводит к уширению спектральной линии и к некоторой потере видимого разрешения. Обычно функцию экспоненциального умножения применяют для спектров 13С-ЯМР, чтобы Рис.4. Вид рабочего окна с ССИ. существенно увеличить соотношение сигнал/шум (рис. 5). Фрагмент спектра 13С-ЯМР (75 МГц) после умножения на 2.3.2.1. Увеличение чувствительности и разрешения спектра экспоненциальную функцию с параметром LB = 2Гц; при уменьшении Доступность данных эксперимента ЯМР в форме временнόго представления, сигнала шума происходит уширение спектральной линии позволяет произвести математические операции над спектром с использованием различных функций, которые управляют отношением сигнал/шум и разрешением спектра. Экспоненциальное умножение (увеличение отношения сигнал/шум) При записи спектра амплитуда сигнала ЯМР затухает во времени, в то время как амплитуда шума остается постоянной, поэтому понижая относительный вклад Фрагмент спектра 13С-ЯМР (75 МГц) без преобразования «хвоста» в конце ССИ, можно увеличить отношение сигнал/шум. Данная операция осуществляется умножением ССИ на спадающую экспоненциальную функцию EM(t) = exp(-PI x LB x t), где LB определяет уширение линии в спектре после проведения преобразования. Для проведения операций над ССИ используется меню Process– Window Function (Alt+P+W), которое открывает диалоговое окно функций и их Рис.5. Увеличение соотношения сигнал/шум после экспоненциального умножения параметров. ССИ. Преобразование лоренцевой линии в гауссову (увеличение разрешения) 7 В данной операции применяются временные функции, которые уменьшают Фрагмент спектра, к которому было применено преобразование с затухание начальной части ССИ, но к концу гладко спадают до нуля. Одной из параметрами LB= -1Гц, GB= 40% наиболее часто используемых является функция, преобразующая лоренцевую линию в гауссову, которая намного ýже у основания, чем соответствующая лоренцева. Данная функция описывается уравнением GM(t) = EM(t) x exp[PI x LB x *(tm2 + t2) / 2tm], где tm = GB x taq и задается параметрами LB и GB, значения которых подбирают попеременно, каждый раз производя преобразование Фурье и исследуя частотное представление Фрагмент изначального спектра без преобразования спектра, чтобы отследить, произошло ли нужное улучшение. Для осуществления данного преобразования выберите Lorenz-Gauss enhance (LB<0) и установите значения LB = -0.4 - -1.7 Hz, GB = 10 - 50%. Затем используйте команду Execute, чтобы выполнить математическую Рис.6. Улучшение разрешения при преобразовании лоренцевой линии в гауссову. операцию. О результате (рис.6) можно будет судить после преобразования Фурье (см. главу 2.3.2.2.). Не существует строго установленных значений для параметров LB и GB, а их 2.3.2.2. Преобразование Фурье (FT) выбор определяется конкретной задачей и видом сигналов в спектре после В результате преобразования преобразования Фурье. С увеличением разрешения возникает несколько Фурье временное представле- нежелательных моментов, на которые следует обратить внимание. Первый момент ние спектра ЯМР трансформи- связан с появлением ложных расщеплений сигналов. Для того чтобы их избежать, в руется в частотное (см. 2.2.). исходном и преобразованном спектрах следует найти сигнал тех протонов, которые Данная операция осуществля- дают синглет и убедиться, что после операции по увеличению чувствительности не ется с помощью команды FT, происходит расщепления данного синглета. Второй момент связан с искажением которая находится либо в интегральных значений сигналов после гауссового преобразования, в связи с чем меню Process (ALT+P+T), либо становится нецелесообразным проведение операции интегрирования спектра. на панели инструментов. 8 2.3.3.1. Коррекция фазы сигналов (Phase Correction) Преобразование Фурье имеет действительную и мнимую части, которым соответствуют сигналы поглощения и дисперсии. Каждый сигнал ЯМР характеризуется не только амплитудой и частотой, но имеет еще и фазу, которая указывает момент времени, соответствующий началу распространения волны. Изменение фазы во временном представлении вызывает смешение действительной и мнимой частей частотного спектра, что приводит к изменению формы линии: появлению наряду с компонентом поглощения также вклада дисперсии (рис.8). FT Рис.8. Изменение фазы сигнала во временном представлении приводит к изменению формы спектральной линии. Операция коррекции фазы очень важна для проведения дальнейшего интегрирования спектра (то есть определения числа протонов, дающих вклад в какой-либо пик). Точность интегрирования сильно зависит от различия фазовых сдвигов сигналов, а изменение фазы сигнала на 5° приводит к изменению интеграла Рис. 7. Преобразование ССИ в частотный спектр в программе Win-NMR. на 1%. В программе Win-NMR коррекция фазы может осуществляться в автоматическом 2.3.3. Операции со спектром 1H-ЯМР. Меню Process (Обработка) и ручном режимах. Автоматическая коррекция фазы (Autom. Phase Correction) После Фурье-преобразования команды, размещенные на панели инструментов, запускается из меню Process, подменю Autom. Phase correction (или комбинацией и внутреннее наполнение меню Process изменяются для проведения последующих клавиш Alt+P+U) и осуществляет коррекцию фазы нулевого и первого порядков в операций со спектром. автоматическом режиме (рис.9). Следует избегать использования этих команд панели инструментов, так как они работают в ! автоматическом режиме и не всегда приводят к корректным результатам. 9 За ходом данной операции можно следить через Коррекция фазы в ручном режиме (Phase Correction) соответствующее диалоговое окно. Однако, Наилучшим образом коррекцию фазы можно осуществить в ручном режиме, для использование автоматического режима не всегда этого необходимо, чтобы в рабочем окне был выведен весь спектр. приводит к полному выравниванию фаз всех сигналов спектра. В этом случае можно повторить Далее в главном меню автоматическую коррекцию еще раз (или Process следует выбрать несколько раз), но наилучший результат всегда Phase correction (комби- дает только ручная коррекция. нация клавиш Alt+P+H). После этого на панели инструментов появится инструментарий для использования ручного режима. Главным инструментом ручного режима корректировки является Slider Box (см. стр. 18), который представляет собой составную кнопку, с помощью которой пользователь может интерактивно изменять значения параметров корректирующих функций. При выборе Phase Correction программа автоматически находит в Autom. спектре сигнал с максимальной интенсивностью и помещает курсор на его пик, при Phase Corr. этом желтым цветом выделяется Далее корректировка проводится в два этапа. На первом корректируют фазу нулевого порядка (сигнала с максимальной интенсивностью, рис.10). Для этого помещают указатель мыши на кнопку ползунка (d), нажимая и удерживая левую клавишу мыши, перемещают ползунок по области (е) и добиваются правильной формы линии сигнала. Далее переключаются на кнопку и перемещают ползунок, выравнивая фазы всех остальных сигналов в спектре (рис. 10). Рис.9. Коррекция фазы сигналов в автоматическом режиме. 10 SLIDER BOX Операции с кнопками Slider Box a c Кнопки (b) и (d) могут быть использованы для изменения значения b b текущего параметра фазы. Каждое нажатие на кнопку (b) смещает ползунок, e приводя к увеличению или уменьшению d значения на 1/10 от предыдущего. Когда g кнопка ползунка достигает правой или f левой границы, диапазон значений может быть расширен нажатием на a) название параметра левую клавишу мыши в поле (е). Кнопки b) стрелки ползунка (f) и (g) показывают минимальное и c) окно значений максимальное значения диапазона, при d) кнопка ползунка нажатии на них диапазон уменьшается e) область перемещения ползунка или увеличивается в 10 раз, т.е. можно f) кнопка нижнего предела значений осуществлять грубую и тонкую g) кнопка верхнего предела значений подстройку фазы. Другие опции панели инструментов меню Phase Correction Запускает простейшую программу для коррекции фазы нулевого порядка Позволяет осуществлять ручной ввод значений Отменяет все операции, проделанные над спектром Выход в главное окно 2.3.3.2. Коррекция базовой линии спектра (Baseline Correction) Состояние базовой линии спектра является важным параметром, который в дальнейшем помогает избежать ошибок при интегрировании спектра. Даже при полном отсутствии шума базовая линия спектра не будет не только нулевой, но и постоянной во всем спектре. В пакеты программного обеспечения включаются сложные процедуры исправления базовой линии, которые позволяют вычитать различные функции из спектра с целью сглаживания базовой линии. Для коррекции базовой линий можно использовать автоматический (коррекция Рис.10. Последовательная коррекция фаз нулевого и первого порядков в ручном по заданному интервалу) и ручной (коррекция по заданным точкам) режимы. Для запуска программы необходимо в главном меню Process выбрать Baseline режиме. Correction (Alt+P+B), после чего появляется диалоговое окно Baseline Correction 11