TH`ESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSIT´E PARIS VI Colloidal stability and folding of antibodies ...

256 Pages·2014·8.51 MB·French

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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS VI
Sp´ecialit´e :
Chimie et Physico-chimie des Polym`eres
Pr´esent´ee par
Nicolas MARTIN
Pour obtenir le grade de
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DOCTEUR de l’UNIVERSITE PARIS VI
Sujet de la th`ese :
Colloidal stability and folding of antibodies in
the presence of chaperone-like poly(acrylate) derivatives
– role of hydrophobic and electrostatic interactions
Soutenue le 24 octobre 2014 devant le jury compos´e de :
Mme Franc¸oise Winnik Pr´esidente
Mme Fouzia Boulmedais Rapportrice
M. Renko De Vries Rapporteur
M Didier Boquet Examinateur
M. Alain Fradet Invit´e
M. Christophe Tribet Directeur de th`ese

Il arrive souvent que lorsque nous pensons
faire une exp´erience sur les autres,
nous en faisons une sur nous-mˆemes.
Oscar Wilde, Le portrait de Dorian Gray
Le Pompier
Vous voulez que je vous raconte des anecdotes ?
Mme Smith
Oh, bien-suˆr, vous ˆetes charmant.
M. Smith, Mme Martin, M. Martin
Oui, oui, des anecdotes, bravo !
[...]
Le Pompier
Je parle de choses que j’ai exp´eriment´ees moi-mˆeme.
La nature, rien que la nature. Pas les livres.
M. Martin
C’est exact, la v´erit´e ne se trouve d’ailleurs
pas dans les livres, mais dans la vie.
Eug`ene Ionesco, La cantatrice chauve

A Nonna et `a M´em´ee

Remerciements
Ma th`ese touche `a sa fin, voici donc venu le traditionnel exercice de la page des remer-
ciements sans lesquels ce manuscrit ne saurait ˆetre complet.
Mes plus chaleureux remerciements vont `a Christophe Tribet pour avoir encadr´e ce
travail de recherche. Christophe, je souhaite t’exprimer ma plus profonde reconnaissance
pour la confiance que tu m’as accord´ee durant ces trois ans, ton enthousiasme `a toute
´epreuve, ta disponibilit´e sans faille (jusque dans les derni`eres relectures attentives de ce
manuscrit), la libert´e d’action que tu m’as laiss´ee et tes encouragements souvent teint´es
d’humour. Je tiens ici a` saluer tes qualit´es d’encadrant, tant humaines que scientifiques,
auxquellesj’ai´et´eextrˆemementsensible. Lesnombreusesdiscussionstoujoursinstructives
que nous avons eues, ton regard critique et tes conseils avis´es ont pour moi ´et´e source
d’inspiration, et seront, j’en suis certain, d’une aide pr´ecieuse pour mon parcours futur.
Je te remercie enfin pour les moyens que tu as mis `a ma disposition, que ce soit dans
mon travail quotidien au laboratoire ou pour me permettre de partir au Canada et de
participer a` plusieurs conf´erences internationales. Pour cela, et pour tout le reste, merci!
Les travaux r´ealis´es au cours de cette th`ese on ´et´e effectu´es au laboratoire PASTEUR
(UMR 8640), au D´epartement de Chimie de l’E´cole Normale Sup´erieure `a Paris. Je
remercie Ludovic Jullien de m’y avoir accueilli. J’ai pu b´en´eficier de conditions de travail
tout a` fait stimulantes au sein de l’unit´e et d’une autonomie qui m’ont permis de muˆrir
scientifiquement.
Je tiens a` remercier Fouzia Boulmedais et Renko de Vries pour avoir accept´e de juger
ce travail de recherche. Je remercie ´egalement Fran¸coise Winnik et Didier Boquet pour
leur participation `a mon jury de th`ese, ainsi que Christine M´enager en sa qualit´e de
pr´esidente du jury.
Ce travail exp´erimental n’aurait pas ´et´e le mˆeme sans le concours d’un grand nombre
de collaborateurs. Je remercie toutes les personnes qui ont apport´e leur pierre, petite ou
grande, `a l’´edifice :
– Fran¸coise Winnik pour les ´echanges fructueux sur nos projets communs et pour
m’avoir accueilli pendant un mois au sein de son laboratoire `a l’Universit´e de
Montr´eal, ainsi que tous les membres de son groupe, notamment Ma Dewang avec
qui j’ai ´etroitement collabor´e pour les travaux sur les IgG, Adeline Laffont pour la
SPR et Jean-Richard Bullet pour la synth`ese de polym`eres;
– Didier Boquet et Amaury Herbet du CEA `a Saclay pour nos discussions en-
richissantes sur les aspects biologiques de ce travail, pour les mesures d’activit´e et
pour les quelques jours/nuits pass´es ensemble a` SOLEIL, ainsi que Narciso Costa,
pourm’avoirr´eguli`erementapprovisionn´eenfragmentsd’anticorps,etC´elineOrtega
v
Remerciements
pour m’avoir initi´e aux protocoles de renaturation;
– Frank Wien pour les mesures de SRCD `a SOLEIL;
– Fabien Ferrage pour la RMN 15N--1H, et Cyril Charlier;
– Damien Laage pour la mod´elisation;
– Fabrice Giusti et Jean-Luc Popot, pour les mesures de SEC `a l’IBPC;
– Guylaine Ducouret et Nicolas Sanson du laboratoire SIMM `a l’ESPCI pour la
viscosim´etrie et l’ultracentrifugation respectivement;
– Ilias Iliopoulos et Sophie Norvez du laboratoire MMC a` l’ESPCI pour le dichro¨ısme
circulaire;
– Thomas Le Saux pour la FCS;
– Emmanuelle Marie pour la synth`ese d’agents RAFT et la GPC;
– Renaud Respaud et Marie-Claude Viaud de l’Universit´e Franc¸ois Rabelais a` Tours
pour l’acc`es aux anticorps monoclonaux th´erapeutiques.
Je remercie ´egalement les enseignants que j’ai cotoy´e durant ces trois ann´ees et qui
ont contribu´e, si ce n’est `a ce travail scientifique, du moins `a ma formation doctorale,
entre autres: H´el`ene Monin-Soyer, Jean-Bernard Baudin, Nicolas L´evy, Gilles Wallez,
Dominique Hourdet, Clotilde Policar, Damien Baigl. Je tenais aussi `a remercier Anne
Hallopp´e pour son aide logistique, toujours dynamique et efficace.
Enfin, je remercie tous les membres du pˆole Chimie BioPhysique pour les moments
que nous avons partag´e, que ce soit repas ou discussions, avec une pens´ee particuli`ere
pour mes compagnons de fortune (d’infortune ?): Louise (et sa motivation sans faille pour
la piscine, “qui fait travailler tous les muscles!”), Geoffrey (et ses gaˆteaux et autres mets
d´elicats – ou pas ! – qu’il nous a cuisin´es), Fabrice (pour son humour et “son” Tariquet
qui nous a conduit a` 3 dans un certain lit “king size”!), Quentin (le seul vrai courageux
face `a l’´epreuve du karaok´e), J´erˆome (pour l’organisation des afterworks “binouze”),
Alexandra (qui nous a suivi dans nos soir´ees).
Je remercie aussi Flore qui a su me remotiver a` un moment crucial de la r´edaction, et
Maxime qui m’a soutenu (support´e ?) et que j’ai embˆet´e jusqu’aux tous derniers instants
de cette aventure.
Je m’arrˆete l`a, et remercierai les autres lorsque j’aurai remport´e un Oscar.
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List of abbreviations
β-CD β-cyclodextrin
p-NPA) para-nitrophenylacetate
ADA anti-drug antibody
ADC antibody-drug conjugate
APBS adaptative Poisson-Boltzmann solver
BLAST basic local alignment search tool
BSA bovine serum albumin
CAB bovine carbonic anhydrase
CD circular dichroism
CDR complementarity-determining region
CHESG cholesterol group-bearing enzymatically synthesized glycogen
CHO Chinese hamster ovary
CHP cholesterol hydrophobically-modified pullulan
cmc critical micellar concentration
CS citrate synthase
CSA (1R)-(−)-10-camphorsulfonic acid
CZE capillary zone electrophoresis
DCC N,N(cid:48)-dicyclohexyl-carbodiimide
DLS dynamic light scattering
DMSO dimethyl sulfoxide
DSC differential scanning calorimetry
DSSP dictionary of protein secondary structure
DTT dithiothreitol
ESG enzymatically synthesized glycogen
ETBR endothelin receptor B
FCS fluorescence correlation spectroscopy
FITC fluoresceine isothiocyanate
FRET F¨orster resonance energy transfer
GMO genetically-modified organism
GndCl guanidinium chloride
GPC gel permeation chromatography
hAMHR-II human anti-Mullerian hormone type II receptor
HSQC heteronuclear single quantum coherence
IB inclusion body
IgG immunoglobulin G
vii
List of abbreviations
IPTG isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
ITC isothermal titration calorimetry
kDa kilo Dalton
LCST lower critical solution temperature
mAb monoclonal antibody
MeO mesityl oxide
MFI mean fluorescence intensity
NMP N-methyl-pyrrolidone
NMR nuclear magnetic resonance
PAA poly(acrylic acid) and poly(sodium acrylate)
PAAm poly(allylamine)
PDMS poly(dimethylsiloxane)
PEAMA poly(N,N-diethylaminoethyl methacrylate)
PEG poly(ethylene glycol
pI isoelectric point
PLA poly(lactide)
PLGA poly(L-glutamic acid)
PLL poly(L-lysine)
PM photomultiplier
PMA poly(methacrylate)
PNIPAM Poly(N-isopropylacrylamide)
PPO poly(propylene oxide)
PrP prion protein
PrPSc prion protein in the Scrapie form
PSS poly(styrene sulfonate)
PVA poly(vinyl alcohol)
SANS small angle neutron scattering
scFv single-chain Fv fragment
SEC size exclusion chromatography
SLS static light scattering
SRCD synchrotron-radiation circular dichroism
TMAO trimethylamine N-oxide
WT wild-type
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