NTE INEN 1529-12: Control microbiológico de los alimentos. Recuento de hifas de mohos

25 Pages·2000·0.98 MB·Spanish

by  Instituto Ecuatoriano de Normalización (INEN)

Republic of Ecuador
≠ EDICT OF GOVERNMENT ±
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NTE INEN 1529-12 (2000) (Spanish): Control
microbiológico de los alimentos. Recuento de
hifas de mohos

INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIÓN

Quito - Ecuador

NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1 529-12:2000

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS.
RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS.

Primera Edición

MICROBILOLOGICAL CONTROL OF FOODS MOLD HYPHAE COUNT.

First Edition

DESCRIPTORES: Alimentos; control microbiológico; ensayos: Howard, Geotrichum, podredumbre.
AL 01.05-319
CDU: 614.31:616.076
CIIU: 9320
ICS: 07.100.30
CDU: 614.31:616.076 CIIU: 9320
ICS: 07.100.30 AL 01.05-319

Norma Técnica CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS. NTE INEN
Ecuatoriana RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS. 1 529-12:2000
Voluntaria 2000-02

1. OBJETO

1.1 Esta norma describe los métodos para determinar el porcentaje de hifas de mohos, realizar el
recuento de hifas de mohos Geotrichum y el de fragmentos de podredumbre.

2. ALCANCE

2.1 Los métodos descritos en esta norma solo son aplicables al tipo de producto que se indica en cada
procedimiento.

3. DEFINICIONES

3.1 Mohos. Son ciertos hongos multicelulares, filamentosos que al desarrollarse se presentan como una
masa de aspecto aterciopelado o algodonoso denominada micelio.

3.2 Hifa. Es cada filamento del micelio.

3.3 Podredumbre. Son partículas de material celular del producto que tienen adheridos una o más hifas
de mohos. Algunos pueden tener la apariencia de casi una masa compacta de mohos.

4. EQUIPOS, MATERIAL Y REACTIVOS

4.1 Equipos y material

4.1.1 Tubos de centrífuga, cónicos graduados, 40 cm3 y de 50 cm3.

4.1.2 Pipetas de 1,0 cm3, con un diámetro interno de 3,0 ± 0,5 mm, de punta ancha.

4.1.3 Lámina y cubreobjetos para el recuento de fragmentos de podredumbre. Lámina de vidrio de 55 mm
x 100 mm x 1,5-4,0 mm de espesor con líneas transversales paralelas que disten entre sí 4,5 mm (su
preparación ver en el Anexo A). Cubreobjetos de 50 mm x 85 mm y aproximadamente 1,5 mm de
espesor.

4.1.4 Celda de Howard para recuento de mohos. Lámina de vidrio hecha de una sola pieza, con un
círculo de superficie plana de aproximadamente 19 mm de diámetro o rectángulo de 20 mm x 15 mm,
rodeado por una canaleta que linda a cada lado con un reborde 0,1 mm más alto que la superficie plana.
El cubreobjetos se coloca sobre el reborde y deja una profundidad de 0.1 mm entre la superficie inferior del
cubreobjetos y la superficie plana. La superficie plana central, rebordes y el cubreobjetos tienen superficies
talladas ópticamente. Para facilitar la calibración del microscopio, las láminas modernas son grabadas con
un círculo de 1,382 mm de diámetro o con dos líneas paralelas finas distantes 1,382 mm.

4.1.5 Microscopio compuesto. Para el recuento de mohos, impurezas y otras alteraciones, el microscopio
debe tener las siguientes especificaciones mínimas: cuerpo binocular con oculares inclinadas; 4 objetivos
acromáticos parafocales de aproximadamente 4X, 10X, 20X y 40X; portaobjetivos giratorio de 4 lugares;
condensador con una abertura numérica (N.A.) de 0,9; Huygenian u oculares 10X de campo amplio; ajuste
fino; platina mecánica.

(Continúa)
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DESCRIPTORES: Alimentos; control microbiológico; ensayos: Howard, Geotrichum, podredumbre.
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4.1.6 Microscopio estereoscópico de campo amplio. Cuerpo binocular con oculares inclinadas;
portaobjetivo corredizo o giratorio para acomodar tres objetivos; tres objetivos parafocales 1X, 3X, y 6 ó
7,5X pareados con oculares de campo amplio de 10X y 15X; armado en una base y apto para iluminación
con luz transmitida y reflejada.

4.1.7 Centrífuga. Centrífuga Internacional tipo EXD con un cabezal No. 240 con ocho lugares, caparazón
No.320, anillos soporte No.325 y protectores No.571 u otra centrífuga que dé el equivalente máximo de la
fuerza centrífuga relativa. Se puede utilizar la siguiente fórmula para determinar la centrífuga equivalente:

N 2 r = N 2 r
1 1 2 2

En donde:

N = 2 200 rpm;
1
r = 19,6 cm (distancia del centro del cabezal a la base del tubo de la centrífuga);
1
N = rpm de la centrífuga equivalente;
2
r = distancia del centro del cabezal a la base del tubo de la centrífuga equivalente.
2

4.1.8 Ciclón de laboratorio o pulpador. Consiste en un tamiz cilíndrico metálico, dentro del cual gira una
paleta que empuja el material suave del alimento a través del tamiz. Los materiales duros tales como
semillas, pieles, tallos, pedúnculos son llevados al extremo del cilindro y echados fuera. Se utiliza como
fuente de energía un motor eléctrico de ¼ de caballo de fuerza, 110 V, 1725 rpm. El tamiz es hecho con
un material de espesor 22, tiene por cm2 62 orificios de 0,69 mm de diámetro cada uno. El diámetro
interno del tamiz es de 6,35 cm y su longitud útil de 7,62 cm. La paleta tiene dos aletas colocadas
alternadamente, cada una tiene un ancho de 19,8 mm que se extienden del centro del eje 30,16 mm. El
ciclón se alimenta por un embudo que conduce a una cubeta de 8,9 cm de largo y 6,35 cm de diámetro
interno. La parte de la paleta con las aletas insertadas en un ángulo de 30° empuja el material de la cubeta
dentro del tamiz. El ciclón es construido de tal manera que la abertura de los desperdicios pueda cerrarse,
cuando sea necesario. El material tamizado es recogido en un protector y llevado por un conducto a un
recipiente. El aparato se puede desarmar fácilmente para lavar.

4.1.9 Mezcladoras. (1) Alta velocidad. Utilizar un vaso de 1 litro con 4 lóbulos, ajustado con un dispositivo
de 4 láminas, dos inclinadas hacia arriba aproximadamente 30° con un diámetro de 60 mm y dos láminas
inclinadas hacia abajo aproximadamente 25° con un diámetro de 55 mm. Funciona a la velocidad indicada
en el método, utilizando un transformador variable. (2) Alta velocidad - Motor suspendido. Es una
alternativa para la mezcladora de alta velocidad. Mezcladora con 6 láminas de acero inoxidable con borde
afilado e inclinadas que giran en el eje del motor suspendido y control de velocidad. Las láminas giran en
el fondo del vaso de acero inoxidable que tiene 4 muescas que forman lóbulos.

4.1.10 Tamices. Nos. 2, 6, 8, 16, 40, 60, 70, 100, 140 y 230. Los tamices No. 100 o más finos deben ser
de acero inoxidable y de "tejido llano" (no asargado) el cual se teje con un alambre alternadamente sobre y
debajo del próximo.

4.2 Reactivos

4.2.1 Solución estabilizadora A.2 (ver Anexo A).

4.2.2 Solución de cristal violeta A.1 (ver Anexo A).

(Continúa)

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5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS
POR EL MÉTODO DE HOWARD

5.1 Productos de tomate.

5.1.1 Jugo. Los recuentos de mohos realizar en el jugo después de homogeneizar la muestra en el
envase. Continuar como se indica en el capítulo 6.

5.1.2 Salsa, puré y pasta

5.1.2.1 Transferir 50 cm3 de solución estabilizadora a un frasco graduado de 100 cm3, adicionar 50 cm3 de
la muestra de salsa homogeneizada y mezclar bien.

5.1.2.2 En el caso de puré y pasta añadir a la muestra agua hasta obtener una mezcla que a 20°C dé un
índice de refracción de 1,3448 - 1,3454 (1,3442 - 1,3448 a 25°C).

5.1.2.3 Agregar 2 a 6 gotas de 2-octanol a cada 100 cm3 de muestra preparada para el recuento, y
continuar según se indica en el capítulo 6.

5.1.3 Sopa de tomate

5.1.3.1 Colocar en agua caliente una lata cerrada y perforada y mantenerla hasta que el contenido se
caliente completamente, y luego, abrirla.

5.1.3.2 Homogeneizar la muestra, transferir 10 cm3 a un tubo de centrífuga de 50 cm3. Si contiene
almidón, adicionar 3 cm3 de NaOH (1 + 1). Agitar hasta que el almidón se disuelva y el tejido esté
transparente.

5.1.3.3 Añadir agua hasta llenar el tubo y centrifugar. El tiempo necesario para centrifugar las muestras
varía grandemente. En una centrífuga con un brazo de 13,34 cm de longitud y una velocidad de alrededor
1 600 rpm se requiere, en la mayoría de los casos, 20 min. En las sopas espesas, la gelatinización del
mucho almidón interfiere a veces con la adecuada sedimentación de los sólidos durante la centrifugación.
Si el líquido permanece turbio, puede ser necesario descartar la muestra e iniciar nuevamente tomando
solo 5 cm3 de sopa y agregando 3 cm3 de la solución de NaOH.

5.1.3.4 Eliminar el sobrenadante cuando es claro; si no es completamente claro, antes de descartarlo,
verificar la presencia de mohos en el sobrenadante.

5.1.3.5 Añadir suficiente agua al residuo del tubo hasta llevar al volumen original de la sopa, mezclar y
contar las hifas de mohos según se indica en el capítulo 6.

5.1.4 Tomate en polvo (ver nota 1)

5.1.4.1 De la muestra bien mezclada, pesar 17 g en un vaso de licuadora de alta velocidad, añadir 150
cm3 de agua para obtener una mezcla equivalente al puré de tomate.

5.1.4.2 Homogeneizar a aproximadamente 3 200 rpm durante 30 segundos y, con una espátula de caucho
remover cualquier material adherido a las paredes. Enjuagar las paredes con 30 cm3 de agua, completar
el volumen hasta 200 cm3 y agitar 1 min.

5.1.4.3 Adicionar dos gotas de 2-octanol para dispersar la espuma y continuar según se indica en el
capítulo 6.

_____________________________
NOTA 1. En la preparación de la muestra del tomate en polvo para el recuento de hifas de mohos no se considera su contenido de humedad
y, la dilución se realiza con agua hasta obtener una mezcla que tenga aproximadamente un contenido de sólidos totales de 8,5 %

(Continúa)

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5.1.5 Tomates enlatados

5.1.5.1 Drenar el contenido de la lata en un tamiz No.2 durante 2 minutos. Para los envases de peso neto
< 1,5 kg, utilizar un tamiz de 203,2 mm de diámetro; para los envases de peso neto igual o > 1,5 kg,
utilizar un tamiz de 304,8 mm. Realizar el recuento de mohos según se indica en el capítulo 6.

5.1.5.2 Examinar los tomates enteros escurridos y anotar el número y tamaño de cualquier porción
deteriorada.

5.1.5.3 Pasar los tomates escurridos por un pulpador de laboratorio. Realizar el recuento de hifas de
mohos en los tomates hechos pulpa, proceder como para jugo según se indica en el capítulo 6.

5.2 Salsa de tomate de conservas de carne con fréjol, pastas, papas, etc. (Aplicable a la salsa que
acompaña la carne con fréjol, tallarines, ravioles, papas, etc).

5.2.1 Colocar en agua caliente una lata cerrada y perforada y mantenerla hasta que el contenido se
caliente completamente y luego abrirla.

5.2.2 Transferir el contenido a un tamiz No.6, drenar hasta que la mayor parte de la salsa haya pasado.
(Con algunos productos la salsa pasa inmediatamente; pero, con otros, como fréjoles y tallarines puede
necesitarse 10 minutos o más).

5.2.3 Mezclar bien la salsa, transferir 10 cm3 a un tubo de centrífuga, adicionar 3 cm3 de NaOH (1 + 1) y
proceder según se indica en 5.1.3.2 al 5.1.3.5 (ver nota 2).

5.3 Salsa de tomate de conservas de pescado

5.3.1 Colocar una lata cerrada y perforada en agua caliente (entre 90 y 95°C) y mantenerla hasta que el
contenido se caliente completamente.

5.3.2 Abrir la lata y drenar el contenido en un tamiz No.6 hasta que la mayor parte de la salsa y el aceite
hayan pasado.

5.3.3 Mezclar bien el líquido, colocar hasta 50 cm3 en un tubo de centrífuga de 50 cm3 y centrifugar como
se indica en 5.1.3.3.

5.3.4 Marcar el volumen de la capa inferior de la salsa libre de aceite y desechar el aceite y parte de la
capa acuosa exenta de mohos.

5.3.5 Adicionar agua hasta completar el volumen marcado, mezclar y contar los mohos como se indica en
el capítulo 6. Antes del recuento, si es necesario, retirar de la lámina los fragmentos de tejido del pescado
(ver nota 2).

5.4 Jugos enlatados de cítricos y de piña. (Aplicable a jugos de concentración simple).

5.4.1 Verter el contenido de la lata en un vaso, mezclar bien transfiriendo entre el vaso y la lata por doce o
más veces.

5.4.2 Del jugo mezclado, transferir 50 cm3 a un tubo de centrífuga cónico graduado de 50 cm3.

5.4.3 Centrifugar 10 min a 2 200 rpm.

__________________________
NOTA 2: En productos que contienen carne, realizar con mucho cuidado los recuentos de hifas de mohos para no confundirlas con las fibras
musculares; pues, éstas aparentemente se parecen, pero las fibras musculares generalmente son más densas y sus estrías, frecuentemente
visibles.

(Continúa)

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5.4.4 Sin frenar y después que la centrífuga se haya parado completamente, retirar los tubos y leer el
volumen del sedimento.

5.4.5 Decantar el sobrenadante sin revolver el sedimento.

5.4.6 Al jugo de piña añadir 0,5 cm3 de HCl (para disolver los cristales de oxalato).

5.4.7 Adicionar H O al tubo para llevar a 10 cm3 y luego añadir 5 cm3 de la solución estabilizadora.
2
Mezclar bien el sedimento con el agua y la solución estabilizadora y verter en un vaso pequeño. Mezclar
bien vertiendo entre el vaso y el tubo por seis o más veces. Agitar bien la mezcla en el vaso.

5.4.8 Hacer el recuento de hifas de mohos como se indica en el capítulo 6.

5.5 Néctares, purés y pastas de frutas

5.5.1 Preparación de la muestra

5.5.1.1 Néctares de frutas. De la muestra bien mezclada, transferir 40 cm3 a un tubo de centrífuga
graduado de 40 cm3, y continuar como se indica en 5.5.2

5.5.1.2 Purés de frutas sin almidón añadido. De la muestra diluida 1+1 con H O y bien mezclada, transferir
2
40 cm3 a un tubo de centrífuga graduado de 40 cm3, y continuar como se indica en 5.5.2

5.5.1.3 Purés de frutas con almidón añadido. En un vaso, pesar 50 g del puré de frutas y adicionar 50 cm3
de una solución de ácido clorhídrico (5 + 45). Mezclar bien y calentar 15 minutos en un baño de vapor. De
esta muestra hidrolizada y bien mezclada, transferir 40 cm3 a un tubo de centrífuga graduado de 40 cm3, y
continuar como se indica en 5.5.2

5.5.1.4 Pastas de frutas. Dispersar 1 parte de pasta en 3 partes de agua. Si es necesario, calentar
suavemente para romper la gel. De esta muestra hidrolizada y bien mezclada, transferir 40 cm3 a un tubo
de centrífuga graduado de 40 cm3, y continuar como se indica en 5.5.2

5.5.2 Centrifugación y corrección de la concentración

5.5.2.1 Centrifugar 10 minutos a 2 200 rpm, sin frenar dejar que la centrífuga se detenga completamente.

5.5.2.2 Retirar los tubos e inmediatamente, sin revolver el sedimento, decantar el sobrenadante. Golpear
delicadamente el tubo para nivelar la superficie del sedimento.

5.5.2.3 Diluir el sedimento con la solución estabilizadora de la siguiente manera:

a) Durazno, albaricoque, mango y papaya: 1 + 1.

b) Pera y guayaba: 1 + 3.

c) Fresa, mora, frambuesa: 1 + 6.

5.5.2.4 Realizar el recuento de mohos por el método de Howard como se indica en el capítulo 6. Para los
productos diluidos 1 + 1 (ver 5.5.2.3 literal a) dividir el número de campos positivos por 2 antes de calcular
el % de mohos.

5.6 Fresas congeladas

5.6.1 Descongelar las fresas y reducirlas a pulpa con un pulpador y mezclar bien, al final, pasar el jugo por
el pulpador.

(Continúa)
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5.6.2 Si es necesario, remover las burbujas de aire por succión o mezclando aproximadamente 100 g de
pulpa con 3 a 5 gotas de 2-octanol. Mezclar bien y realizar el recuento de mohos como se indica en el
capítulo 6.

5.7 Especias en polvo (Aplicable a ajo molido, páprica, pimienta roja y de cayena, ají en polvo, chili y
otros pimientos grandes).

5.7.1 De la muestra bien mezclada de la especia en polvo, pesar 10 g y transferir a una licuadora de alta
velocidad.

5.7.2 Adicionar, en tres o cuatro porciones sucesivas, 200 cm3 de una solución de NaOH al 1%. Después
de cada adición homogeneizar a aproximadamente 13 000 rpm por 5 segundos, con la porción final de la
solución de NaOH remover cualquier material adherido a las paredes de la licuadora.

5.7.3 Homogeneizar la mezcla 1 minuto a 13 000 rpm. Con una espátula de caucho, hacer caer en la
mezcla cualquier material adherido a las paredes y repetir la homogeneización por 2 min más.

5.7.4 Adicionar dos o tres gotas de 2-octanol para deshacer la espuma.

5.7.5 Mezclar 100 g de esta muestra preparada con 50 g de la solución estabilizadora y continuar como se
indica en el capítulo 7 (ver nota 3).

5.8 Alimentos infantiles en papilla

5.8.1 Antes del recuento, adicionar aproximadamente 0,2 g de NaOH en aproximadamente 6 g de
producto y agitar bien hasta que el NaOH se disuelva. Continuar según se indica en el capítulo 6.

6. MÉTODO DE HOWARD

6.1 Procedimiento.

6.1.1 Limpiar la celda de Howard de manera que en los puntos de contacto, entre el reborde de la celda y
el cubreobjeto, se produzcan los anillos de Newton. Mezclar bien la muestra, retirar el cubreobjeto, y con
una lámina o escalpelo (de preferencia, plástico) colocar una pequeña gota sobre la superficie plana
central (o disco) de la celda. Con el mismo instrumento, esparcir la gota uniformemente sobre toda la
superficie plana central o del disco. Utilizar la cantidad suficiente de muestra solo para cubrir la superficie
plana central hasta el borde (ver nota 4).

6.1.2 Colocar el cubreobjeto de la siguiente manera: mantener el cubre sobre la celda en una posición tal
que forme un ángulo de 45°, luego, dejarlo caer con cierta rapidez, pero no demasiada.

6.1.3 Descartar cualquier lámina que presente una distribución desigual, o ausencia de los anillos de
Newton, o líquido escurrido por la canaleta o entre el reborde y el cubreobjeto.

__________________________
NOTA 3. Ocasionalmente, la mezcla homogeneizada contiene partículas de tejidos de hojas que dificultan la formación de los anillos de
Newton en la cámara de Howard preparada para el recuento de mohos. El dispositivo ideado para mantener la lamínula en su lugar y obviar
esta dificultad consiste en una lámina metálica con una abertura de 2,5 cm de diámetro, en el centro de la lámina; dos abrazaderas fijadas al
borde de la lámina mantienen la lamínula en posición cuando se la coloca sobre la lámina. También, se pueden retirar las partículas de hojas
de la cámara de Howard con una micro-pinza.

NOTA 4. Es de suma importancia que la gota se tome de la muestra muy bien homogeneizada y que se le distribuya uniformemente sobre
toda la superficie plana central. De otro modo, cuando se coloca el cubreobjeto, el material insoluble, y consecuentemente los mohos, pueden
concentrarse más en el centro de la celda.

(Continúa)

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6.1.4 La celda preparada colocar en el microscopio y examinar con un aumento tal para que el campo
visible sea de 1,5 mm2. Esta área es esencial y frecuentemente puede obtenerse tan solo ajustando el
largo del cañón del microscopio de manera que el diámetro del campo sea de 1,382 mm (las celdas de
Howard tienen dos líneas paralelas o un círculo para verificar el área del campo). Cuando es imposible
este ajuste, colocar en el ocular un diafragma cuya abertura sea exactamente la deseada. El diámetro del
área del campo puede determinarse con un micrómetro. Cuando el instrumento está adecuadamente
ajustado, el volumen del líquido examinado por campo es 0,15 mm3. Utilizar un aumento de 90 a 125X.
Cuando en un campo estándar es difícil percibir las características de las hifas de mohos, utilizar un
aumento de aproximadamente 200X (objetivo de 8 mm) para confirmar la identidad de las hifas de mohos
previamente observadas en el campo estándar (en el Anexo B se describen las características de las hifas
de mohos).

6.1.5 De cada dos o más preparaciones, examinar mínimo 25 campos tomados de manera que se
obtenga un resultado representativo de todas las secciones de la preparación.

6.1.6 Examinar cada campo, observar la presencia o ausencia de hifas y registrar el resultado como
positivo o negativo; ningún campo puede registrarse como positivo más de una vez. Un campo se
considera como positivo si cualquiera de las siguientes longitudes excede 1/6 del diámetro del campo
(para tener como positivo un campo, no es suficiente 1/6 del campo, la suma de las longitud debe
"exceder" 1/6 del diámetro del campo):

6.1.6.1 La longitud de un solo filamento, sin ramas.

6.1.6.2 La longitud de un solo filamento más la longitud de sus ramas (longitud agregada).

6.1.6.3 La longitud agregada de dos filamentos de mohos.

6.1.6.4 La longitud agregada de tres filamentos de mohos (no pueden sumarse las longitudes de más de
tres filamentos de mohos).

6.1.6.5 La longitud agregada de todos los filamentos de un grumo de mohos (a un grumo de mohos se le
considera una sola pieza y están consideradas las longitudes de todos los filamentos).

6.1.7 Se deben preparar dos láminas y la diferencia entre el número de campos positivos obtenidos no
debe ser mayor que 3; caso contrario, se preparará una tercera lámina. Para mayor precisión preparar un
número mayor de láminas.

6.2 Cálculos e informe de resultados

6.2.1 Calcular el porcentaje de campos positivos utilizando la siguiente fórmula:

No.decampospositivos
%decampospositivos= x100
No.decamposexaminados

6.2.2 Informar los resultados como % de campos positivos.

7. RECUENTO DE HIFAS DE MOHOS GEOTRICHUM

7.1 Preparación de la muestra

7.1.1 Bebidas no alcohólicas

(Continúa)

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