Development of an in vivo selection system for the identification of antibacterial cyclic peptides

143 Pages·2015·6.06 MB·English

DEPARTMENT CHEMIE
LEHRSTUHL FÜR BIOCHEMIE

Development of an in vivo selection system
for the identification of antibacterial cyclic
peptides

Sabrina Theresa Harteis

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität
München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.‐Prof. Dr. Lukas Hintermann
Prüfer der Dissertation: 1. TUM Junior Fellow Dr. Sabine Schneider
2. Univ.‐Prof. Dr. A. Stephan Sieber

Die Dissertation wurde am 11.09.2015 an der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 15.10.2015 angenommen.

FÜR MEINE FAMILIE

ACKNOLEDGEMENTS 
Acknowledgements 

This thesis was realized at the Chair of Biochemistry at the Technische Universität
München from november 2011 until september 2015.
I would like to thank Dr. Sabine Schneider for providing me the opportunity to carry
out my PhD in her group, her interest in my work and her steady support in this
challenging project.
Special Thanks go to
…Prof. Dr. Stephan A. Sieber and his group members for the productive
cooperations. Many thanks go to Max Koch for the pleasant teamwork and all the
discussions. Furthermore, I would like to thank Katja Bäuml for introducing me into
the handling of the mass spectrometer.
…Prof. Michael Groll for integrating me into his group and for giving me the
unlimited permission to use all of his facilities.
…my colleagues for the good working atmosphere and especially Dr. Veronika
Flügel, Christine Oellig, Marion Kirchner and Dr. Andrea Kunfermann for their
encouraging words and their advice at all the time.
…the technicians Richard Feicht, Christine Schwarz, Ursula Seidel and the secretary
Ute Kashoa and especially Astrid König for the friendly help, support and daily work.
…my students Florian, Anja, Lily, Susi, Patrizia and Matthias.
…Dr. Annika Frank, Dr. Andrea Kunfermann and Dr. Ernie Star for proofreading.
I also want to thank Dr. David Schlereth, Sabine Rittinger, Markus Meier, Sebastian
Foraita, and Alexander Henze for our weekly Friday lunch and for sharing good and
bad moments.
A special thank goes to my parents, brother and grandparents for all the support and
encouragement not only during my PhD but also in all life situations. Last but not
least, my major gratuity goes to my husband Uli for the encouraging words and love
he is giving me every day.

ZUSAMMENFASSUNG 
Zusammenfassung 
Riboschalter sind strukturierte RNA Elemente im 5’ untranslatierten Bereich der
mRNA, die die Expression essentieller Gene regulieren. Da sie hauptsächlich in
Bakterien vorkommen, sind sie ein interessantes Angriffsziel für die Entwicklung
neuer Medikamente. Mögliche Inhibitoren für Riboschalter sind zyklische Peptide,
die sich besonders durch ihre hohe biochemische Stabilität auszeichnen und die
aufgrund ihrer starren Konformation gute Bindeaffinitäten aufweisen. Darüber
hinaus sind bereits viele bioaktive zyklische Peptide bekannt, die antibakterielle,
immunosuppressive oder anti‐tumor aktive Eigenschaften besitzen. In den letzten
Jahren wurden Methoden entwickelt, um zyklische Peptide genetisch zu kodieren
und zu exprimieren.
Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Selektionssystems, das die
Identifizierung von zyklischen Peptiden erlaubt, die selektiv an den Coenzym B
12
Riboschalter aus Salmonella typhimurium binden. Dazu wurden verschiedene
Konstrukte kloniert, bei denen der Riboschalter die Expression von Reportergenen
kontrolliert. Die Qualität der Regulation wurde mit Hilfe des natürlichen Liganden
Coenzym B geprüft. Es zeigte sich eine erfolgreiche Regulierung der Reportergene
12
lacZ und sacB mit dem Riboschalter, wodurch ein dreistufiges in vivo
Selektionsverfahren mit Hilfe einer zyklischen Peptidbibliothek etabliert werden
konnte. Darüber hinaus wurde die Effektivität, mit der zyklische Peptide in vivo
generiert werden, untersucht. Die DnaE Split‐Inteine aus Synechocystis sp. Strain
PCC6803 und Nostoc punctiforme wurden für die in vivo Zyklisierung der Peptide
herangezogen. Mittels Zellextraktionen und synthetisierten Referenzpeptiden
konnte somit erfolgreich die Menge von vier in vivo generierten zyklischen Peptiden
massenspetrometrisch quantifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit dienen als
Grundlage weiterer Forschung zur Untersuchung des Coenzym B Riboschalters aus
12
Salmonella typhimurium und der Identifizierung von biologisch aktiven zyklischen
Peptiden in vivo.

ABSTRACT 

Abstract 
Riboswitches are structured RNA elements in the 5‘untranslated region of mRNA
that regulate expression of essential genes. As they predominantly occur in bacteria,
riboswitches constitute an interesting target for drug development. A possible
compound class to target riboswitches are cyclic peptides. They possess high
stability and a conformational rigidity which allows a high binding affinity towards
target molecules. There are also many bioactive cyclic peptides with antibacterial,
immunosuppressive or anti‐tumor activity. In the last years methods have been
developed to genetically encode and express cyclic peptides.
The aim of this work was to establish an in vivo selection system that allows the
identification of cyclic peptides, which selectively bind coenzyme B riboswitch
12
from Salmonella typhimurium. For this purpose, several constructs were cloned in
which the expression of reporter genes was controlled by the riboswitch. The
quality of regulation was examined by addition of the natural ligand coenzyme B . A
12
successful regulation of the reporter genes lacZ and sacB was observed and a three‐
step in vivo screening system using a cyclic peptide library was developed.
Furthermore, to optimize the cyclic peptide library, sequence dependency of cyclic
peptide generation was investigated. For this purpose, in vivo cyclization efficacy of
four different cyclic peptide sequences was investigated by using DnaE split inteins
from Synechocystis sp. Strain PCC6803 and Nostoc punctiforme for cyclization. Cell
extraction and chemically synthesized reference peptides led to the successful
quantification of in vivo generated cyclic peptides by mass spectrometry.
Results of this work serve as a basis for further research on the coenzyme B
12
riboswitch from Salmonella typhimurium and the identification of biologically active
cyclic peptides in vivo.