DESARROLLO DE MODELOS CELULARES Y ANIMALES PARA EL ESTUDIO DE TERAPIA PDF
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ADVERTIMENT. Lʼaccés als continguts dʼaquesta tesi queda condicionat a lʼacceptació de les condicions dʼús establertesperlasegüentllicènciaCreativeCommons: http://cat.creativecommons.org/?page_id=184 ADVERTENCIA.Elaccesoaloscontenidosdeestatesisquedacondicionadoalaaceptacióndelascondicionesdeuso establecidasporlasiguientelicenciaCreativeCommons: http://es.creativecommons.org/blog/licencias/ WARNING.Theaccesstothecontentsofthisdoctoralthesisitislimitedtotheacceptanceoftheuseconditionsset bythefollowingCreativeCommonslicense: https://creativecommons.org/licenses/?lang=en ESCUELA DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA, BIOLÓGICA Y AMBIENTAL Doctorado en Biotecnología DESARROLLO DE MODELOS CELULARES Y ANIMALES PARA EL ESTUDIO DE TERAPIA GÉNICA NO VIRAL ANTI-‐ ANGIOGÉNICA EN RETINA -‐ Tesis doctoral -‐ Anna Salas Torras Los directores de la tesis: Dr. José García Arumí Dr. Simo Schwartz Navarro Dra. Ibane Abasolo Olaortua Catedrático de Oftalmología. Jefe del grupo CIBBIM-‐ IP del grupo CIBBIM-‐ Universitat Autònoma de Nanomedicina. Direccionamiento y Nanomedicina. Direccionamiento y Barcelona liberación farmacológica. liberación farmacológica. Vall d’Hebrón Institut de Recerca. Vall d’Hebrón Institut de Recerca. Bellaterra, Junio 2017 2 3 A la meva familia. 4 5 6 7 ÍNDICE INTRODUCCIÓN 13 I1. EL OJO 15 I1.1. LA RETINA Y LA FUNCIÓN VISUAL 16 I1.2. EL SISTEMA VASCULAR OCULAR 19 I2. PATOLOGÍA DE LA RETINA 20 I2.1. PRINCIPALES ENFERMEDADES OCULARES CAUSANTES DE PÉRDIDA DE VISIÓN 20 I2.2. LA RETINOPATÍA DIABÉTICA 21 I2.2.1. Progresión y principales acontecimientos patológicos de la RD 22 I2.2.2. Principales terapias para la RD 24 I2.3. LA DEGENERACIÓN MACULAR ASOCIADA A LA EDAD 26 I2.3.1. Progresión y patogenia de la DMAE 27 I2.3.2. Principales terapias para la DMAE 28 I3. MODELOS ANIMALES DE RD Y DMAE 30 I3.1. PRINCIPALES MODELOS DE RD 30 I3.1.1. Modelo de RD en rata inducido con estreptozotocina (STZ). 32 I3.2. PRINCIPALES MODELOS DE DMAE 33 I3.2.1. Modelo de DMAE húmeda: neovascularización coroidea inducida con láser en ratón 34 I4. FACTORES IMPLICADOS EN EL CONTROL DE LA NEOVASCULARIZACIÓN OCULAR 35 I4.1. EL FACTOR DERIVADO DE EPITELIO PIGMENTADO 36 I4.1.1. Propiedades tróficas del PEDF 37 I4.1.2. Propiedades neuroprotectoras del PEDF 38 I4.1.3. Propiedades anti-‐angiogénicas del PEDF 38 I4.1.4. El PEDF como factor terapéutico en RD y DMAE 39 I4.2. LA SOMATOSTATINA 39 I4.2.1. Propiedades neuromoduladoras de la SST 40 I4.2.2. Propiedades anti-‐angiogénicas de la SST 41 I4.2.3. La SST como agente terapéutico en RD y el DMAE 41 I5. NANOMEDICINA Y TERAPIA GÉNICA OCULAR 42 I5.1. TERAPIA GÉNICA OCULAR 42 I5.2. TERAPIA GÉNICA NO VIRAL 46 I5.2.1. ADN desnudo 46 I5.2.2. Métodos físicos 46 I5.2.3. Métodos químicos 47 I5.3. NPS POLIMÉRICAS POLIPEPTÍDICAS: R9-‐GFP-‐H6 49 I5.4. NPS POLISACÁRIDAS: QUITOSANOS 51 OBJETIVOS 53 MATERIAL Y MÉTODOS 57 MM1. CULTIVOS CELULARES 59 MM1.1. LÍNEAS CELULARES, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 59 MM1.1.1. Protocolo de sub-‐cultivo 59 8 MM1.2. ENSAYO DE PROLIFERACIÓN ENDOTELIAL 60 MM1.2.1. Ensayo MTT 60 MM1.3. ENSAYO DE MIGRACIÓN ENDOTELIAL 61 MM1.4. ENSAYO DE FORMACIÓN TUBULAR 61 MM1.4.1. Establecimiento del co-‐cultivo de fibroblastos y células endoteliales 61 MM1.4.2. Ensayo de angiogénesis con PEDF y SST 62 MM1.4.3. Immunocitoquímica anti-‐vWf 62 MM1.5. ENSAYOS DE TRANSFECCIÓN 63 MM1.5.1. Transfección con X-‐Treme 63 MM1.5.2. Inmunocitoquímica 63 MM1.5.3. Citometría de Flujo 65 MM1.5.4. Extracción de RNA y qPCR 65 MM2. GENERACIÓN DE LOS VECTORES DE EXPRESIÓN DE PEDF, SST Y TDTOMATO. 66 MM2.1. MATERIALES Y REACTIVOS 66 MM2.2. CLONACIÓN DIRECCIONADA DE LOS GENES PEDF, SST Y TDTOMATO EN EL VECTOR PMC.BESPX 66 MM2.3. INTRODUCCIÓN DEL PROMOTOR VMD-‐2 Y LA SECUENCIA S/MAR EN LOS PLÁSMIDOS PMC.PEDF, PMC.SST Y PMC.TDTOMATO. 68 MM2.3.1. Extracción de ADN genómico de ARPE-‐19 68 MM2.3.2. Clonación direccionada de las secuencias VMD-‐2 y SMAR 68 MM2.4. GENERACIÓN DE LOS MINICÍRCULOS 71 MM2.4.1. Generación de bacterias ZYCY10P3S2T electrocompetentes 71 MM2.4.2. Generación de los minicírculos 71 MM3. EXPERIMENTOS CON ANIMALES: TÉCNICAS IN VIVO 72 MM3.1. ANIMALES USADOS EN LOS PROCESOS EXPERIMENTALES 72 MM3.2. GENERACIÓN DEL MODELO DE DIABETES INDUCIDO CON ESPTREPTOZOTOCINA (STZ) EN RATA 73 MM3.3. GENERACIÓN DEL MODELO DE NEOVASCULARIZACIÓN COROIDEA EN RATÓN MEDIANTE FOTOCOAGULACIÓN CON LÁSER 74 MM3.4. ELECTRORETINOGRAMA 75 MM3.4.1. Electroretinograma Ganzfeld en el modelo de diabetes inducida en rata 75 MM3.4.2. Electroretinograma focal en el modelo de NVC en ratón 76 MM3.5. ANGIOGRAFÍA FLUORESCEÍNICA 77 MM3.5.1. AF en modelo de diabetes en rata 77 MM3.5.2. AF en modelo de NVC en ratón 77 MM3.6. TOMOGRAFÍA DE COHERENCIA ÓPTICA 78 MM3.7. INYECCIÓN SUB-‐RETINIANA 78 MM4. EXPERIMENTOS CON ANIMALES: TÉCNICAS POST-‐MORTEM 79 MM4.1. EUTANASIA Y PROCESAMIENTO DE LOS TEJIDOS 79 MM4.2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS GENÉTICO 80 MM4.2.1. Extracción de RNA 80 MM4.2.2. Retrotranscripción y PCR a tiempo real 80 MM4.3. TÉCNICAS DE ANÁLISIS HISTOLÓGICO 80 MM4.3.1. Hematoxilina/Eosina 80 MM4.3.2. Inmunofluorescencia en flat-‐mounts 81 MM4.3.3. Inmunofluorescencia en criosecciones 81 MM4.3.4. TUNEL 82 MM5. PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS PROTEICAS R9-‐GFP-‐H6 83 9 MM6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 84 RESULTADOS 85 RESULTADOS -‐ PARTE I: ESTUDIOS IN VITRO DE LA ACCIÓN ANTI-‐ANGIOGÉNICA DEL FACTOR DERIVADO DE EPITELIO PIGMENTADO Y LA SOMATOSTATINA 87 R1.1-‐ EL PEDF Y LA SST INHIBEN LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES INDUCIDA POR VEGF 89 R1.2-‐ EL PEDF Y LA SST INHIBEN LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES INDUCIDA POR VEGF 89 R1.3-‐ EL PEDF Y LA SST INHIBEN LA FORMACIÓN DE ESTRUCTURAS TUBULARES IN VITRO 91 RESULTADOS -‐ PARTE II: GENERACIÓN DE MODELOS ANIMALES PARA EL ESTUDIO DE TERAPIA GÉNICA OCULAR CON PEDF Y SST 93 R2.1-‐ MODELO INDUCIDO DE RETINOPATÍA DIABÉTICA NO PROLIFERATIVA EN RATA 95 R2.1.1. Inducción de la diabetes con STZ 95 R2.1.2. Evaluación in vivo de la función visual 96 R2.1.2.1. Análisis del ERG a 1 mes post-‐inducción. 97 R2.1.2.2. Análisis del ERG a 2 meses post-‐inducción. 99 R2.1.2.3. Análisis del ERG a 3 meses post-‐inducción. 101 R2.1.2.4. Progresión cronológica de la respuesta ERG de ratas STZ. 103 R2.1.3. Análisis angiográfico 105 R2.1.4. Evaluación post-‐mortem de los eventos patológicos en la retina 106 R2.1.4.1. Análisis morfológico 107 R2.1.4.2. Análisis de la expresión génica 108 R2.1.4.3. Análisis inmunohistoquímico 109 R2.2-‐ MODELO DE NEOVASCULARIZACIÓN OCULAR EN RATÓN 111 R2.2.1. Generación del modelo de NVC mediante fotocoagulación con láser verde de 532 nm 111 R2.2.2. Caracterización in vivo de la progresión de las lesiones 113 R2.2.3. Evaluación de la función visual mediante electroretinograma focal (fERG) 116 R2.2.4. Cuantificación de las áreas neovasculares mediante inmunofluorescencia en flat-‐mounts 118 R2.2.5. Evaluación de la expresión génica 119 R2.2.6. Evaluación histológica 122 R2.3-‐ INYECCIÓN SUB-‐RETINIANA PARA ADMINISTRACIÓN DE TERAPIA GÉNICA OCULAR 124 R2.3.1. Puesta a punto de la técnica de inyección sub-‐retiniana en roedores 124 R2.3.2. Caracterización de los eventos derivados de la inyección 125 R2.3.3. Transfección con Lipofectamina® y plásmido de expresión de tdTomato en EPR de rata mediante inyección sub-‐retiniana 126 RESULTADOS -‐ PARTE III: ESTUDIO DE SISTEMAS NO VIRALES DE TERAPIA GÉNICA EN RETINA 129 R3.1-‐ GENERACIÓN DE VECTORES NO VIRALES DE EXPRESIÓN DE PEDF Y SST 131 R3.1.1. Clonación de los vectores plasmídicos 131 R3.1.2. Generación de los minicírculos 131 R3.1.3. Análisis in vitro de la expresión de tdTomato, SST y PEDF 133 R3.2-‐ ESTUDIO DE LAS NANOPARTÍCULAS PROTEICAS R9-‐GFP-‐H6 COMO SISTEMAS TRANSFERENCIA GÉNICA NO VIRAL EN RETINA 135 R3.2.1. Producción y caracterización de las nanopartículas R9-‐GFP-‐H6 135 R3.2.2. Estudios de unión a ADN plasmídico 137
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