Análise genômica e pós - genómica de proteínas de Leishmania Chagasi

197 Pages·2004·0.93 MB·Portuguese

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Ana Paula Pimentel Cassilhas

Análise genômica e pós-genômica de proteínas de
Leishmania chagasi

Recife
Abril / 2003
ANA PAULA PIMENTEL CASSILHAS

ANÁLISE GENÔMICA E PÓS-GENÔMICA DE
PROTEÍNAS DE Leishmania chagasi

Tese defendida no Curso de
Doutorado em Ciências
Biológicas da Universidade
Federal de Pernambuco para
obtenção do título de Doutor em
Ciências Biológicas, Área de
Concentração em
Microbiologia.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Paes de Andrade
(Departamento de Genética - UFPE)
Co-orientadora: Profa. Dra. Cynthia Rayol de Andrade
(Departamento de Histologia e Embriologia - UFPE)

Recife
Abril / 2004
ANÁLISE GENÔMICA E PÓS-GENÔMICA DE PROTEÍNAS DE
Leishmania chagasi

Ana Paula Pimentel Cassilhas

COMISSÃO EXAMINADORA
Membros Titulares

Prof. Dr. Paulo Paes de Andrade
Departamento de Genética – UFPE (Orientador)

Profa. Dra. Luana Cassandra B. B. Coelho
Departamento de Bioquímica - UFPE

Profa. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal - UFRPE

Profa. Dra. Marise Sobreira Bezerra da Silva
Departamento de Microbiologia - CPqAM / FIOCRUZ – PE

Profa. Dra. Tereza Cristina Leal Balbino
Departamento de Microbiologia - CPqAM / FIOCRUZ – PE

Membros Suplentes

Profa. Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida
Departamento de Microbiologia - CPqAM / FIOCRUZ – PE

Profa. Dra. Neide Santos
Departamento de Genética - UFPE
Ao meu pai e minha mãe que regaram a semente
do questionamento em todo o tempo desde a minha
iniciação científica.

À Júnior e ao meu filho Bruno que me deram tanta
força para concluir mais uma etapa da minha vida.

Dedico este trabalho.
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS i
LISTA DE TABELAS ii
LISTA DE FIGURAS iii
LISTA DE ABREVIATURAS viii
RESUMO xi
ABSTRACT xii
0
1 – Introdução 01
1
0
2 - Revisão de literatura 03
3
0
2.1 – Leishmanioses 03
3
2.2 - Leishmaniose visceral ou calazar
05
2.3 - Agente etiológico
07
2.4 - Ciclo de vida
09
2.5 - Terapêutica e controle
11
2.6 - Resposta imune no Calazar
12
2.7 - Imunidade pós-tratamento 13
2.8 - Vacinas em andamento
14
2.8.1 - Vacinas de 1ª geração
14
2.8.2 - Vacinas de 2ª geração
15
2.9 - Proteínas de choque térmico (HSP)
19
2.10 - HSP70 e a resposta imune
21
2.11 - Resposta anti-HSP70 no calazar
24
2.12 - HSP 83 do gênero Leishmania e a resposta imune
26
2.13 - HSP83 e a resposta imune no calazar
27
2.14 - Genomas de parasitas
28
2.15 - Genética de Leishmania
33
2.16 - Bioinformática
36
2.16.1 - Anotação de genes
36
38
2.16.2 - Alinhamento múltiplo de seqüências
3 – Referências 42
4 – Capítulos
60

Capítulo I: Identificação in silico e in vitro de domínios antigênicos
em HSP70 de Leishmania chagasi 66

Capítulo II: Epitopos, sítios de trans-encadeamento e poli-adenilação
na HSP83 de Leishmania chagasi: uma análise in silico.
92

Capítulo III: O transcriptoma da Leishmania chagasi: lições das primeiras
114
10.000 sequências
135
5 – Conclusões
135
Capítulo I
136
Capítulo II
137
Capítulo III
138
Anexos

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelas oportunidades de continuar fazendo o que gosto.
Ao Prof. Dr. Paulo Paes de Andrade, pela orientação e confiança durante a
realização deste trabalho;

À Profa. Dra. Cynthia Rayol de Andrade, pela dedicação como profissional e
amiga;

À Profa Eliete Cavalcanti da Silva e à Profa. Giovanna Negromonte Torquato, pela
amizade e convivência intensas durante este período;

Ao Dr. Marcel Ramirez, pela ajuda científica em uma fase do trabalho;

À Biomédica Daniela Bezerra Lóssio, que como aluna de iniciação científica do
Laboratório de Genética Molecular fez do período de convivência o que se espera
no início de uma vida científica, com dedicação e colaboração durante a
realização deste trabalho;

À Rafael Queiroz pela atenção, amizade e ajuda em várias fases de execução do
trabalho;

Ao Dr. Frederico Abath, Dr. Roberto Werkauser, Prof. Mineo Nakazawa e Profa.
Edeneide Xavier do Depto. de Imunologia, do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães/FIOCRUZ, pela facilidade no uso das instalações desta Instituição;

À D. Zizi e à Celuza, pelo apoio “logístico” para a realização dos experimentos;

Aos colegas de turma do Curso de Doutorado (2000), pelo convívio e
aproveitamento científico durante a primeira fase do percurso;

À Profa. Mileide Montenegro, pela ajuda sempre eficiente nos ensaios
imunológicos;

Aos colegas do Laboratório de Genética Molecular do Depto. de Genética/UFPE,
Guerrinha, Mirelle, Márcio, Valdir, Márcia, Marcelo, Ivone, Geórgia, Mércia, Ivone,
Igor, Marcílio, Marília, Marcelo, que de alguma forma contribuíram para a
execução deste trabalho.

À CAPES, FACEPE e CNPq, pelo apoio financeiro.

LISTA DE TABELAS

REVISÃO DE LITERATURA
Tabela 1 Painel eco-epidemiológico da leishmaniose visceral, mostrando o
gênero Lutzomyia, flebótomos vetores, as espécies de Leishmania,
com seus respectivos sub - gêneros (Leishmania ou Viannia), e a
respectiva distribuição geográfica nas Américas................................. 07

Tabela 2 Lista de antígenos recombinantes testados no TDR........................... 32

CAPÍTULO III

Tabela 1 Uso de códon Leishmania chagasi – (31 genes: 6.551 códons).
Os códons mais utilizados estão representados de vermelho e
aqueles menos utilizados, de
azul..................................................................... 129

Tabela 2 Seqüências filogeneticamente restritas à família
Trypanosomatidae.. 130/131
LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DE LITERATURA

Figura 1 Distribuição das leishmanioses visceral (esquerda) e cutânea ou
tegumentar (direita) no Mundo (TDR, 2002). As duas endemias
ocorrem em áreas tropicais e sub - tropicais, inclusive em torno do
Mediterrâneo. A leishmaniose visceral pode ser encontrada em países
de clima relativamente frio, como Portugal, França, Espanha e Grécia
e em países dos Bálcãs. A leishmaniose tegumentar também pode
ocorrer em países de clima temperado. ................................................. 06

Figura 2 Gráficos representativos da incidência de casos de calazar por região
brasileira.Fonte:http://www.sucen.sp.gov.br/doencas/leish_visc/........... 08

Figura 3A Promastigotas, formas flageladas de Leishmania, com o núcleo
ovalado e mais corado (seta) e o cinetoplasto, localizado abaixo da
estrutura nuclear (seta menor)................................................................ 10

Figura 3B Presença de amastigotas intracelulares (setas) de L. infantum
infectando o citoplasma do macrófago de hamster. O núcleo da célula
hospedeira pode ser visto corado em rosa. Fonte: http:// www -
medlib.med.utah.edu/parasitology/ldonoim.html..................................... 10

Figura 4 Fêmea hematófaga do Lutzomyia longipalpis realizando o repasto
sanguíneo. Fonte: http://www.niaid.nih.gov/newsroom/focuson
bugborne01/leish-htm.............................................................................. 11

Figura 5 Ciclo de vida da L. chagasi mostrando a picada do inseto e inoculação
no hospedeiro de formas promastigotas, a interiorização em
macrófagos e posterior diferenciação em amastigotas. As amastigotas
intracelulares se multiplicam até romperem a célula hospedeira,
transformando-se em promastigotas novamente, circulantes no
sangue, para então serem capazes de infectar novas células ou
infectarem o inseto, no momento do repasto sanguíneo. No interior do
intestino médio do inseto, as formas promastigotas se multiplicam e
migram para o aparelho bucal, a fim de infectarem o hospedeiro
vertebrado novamente, durante o repasto sanguíneo, fechando assim
o ciclo evolutivo....................................................................................... 12
Figura 6 Representação esquemática do processo de transcrição em
Leishmania. No lado esquerdo da figura está representada a
transcrição das três classes de genes que codificam o precursor do
mini-exon. Da seqüência original de 363nt do genoma, apenas 107
são transcritos, sendo apenas 39nt transencadeados para a região 5’
do mRNA policistônico. Os processos de transencadeamento e
poliadenilação completam a transcrição, produzindo mRNA maduros
monocistrônicos. Fonte: Adaptação da figura de Montenegro (2003),
baseada nas revisões de Stiles et al.,1999 e
Clayton,2002........................................................................................... 15

Figura 7 Atuação das HSP70 sobre o enovelamento das proteínas recém
sintetizadas no ribossomo. As chaperoninas ligam-se ao polipeptídeo
formando uma série de complexos de ligações, com gasto de duas
moléculas de ATP, auxiliando no enovelamento funcional da proteína.
Figura adaptada do site: http://www.med.hokudai.ac.jp/~bio-1w/
kogi/files/6-83.jpg.. 22

Figura 8 Ação das chaperoninas durante o transporte protéico. O polipeptídeo
parcialmente desdobrado é transporte do citosol para a mitocôndria.
Chaperoninas citosólicas estabilizam a configuração desdobrada e as
proteínas mitocondriais facilitam o transporte e, subseqüentemente, o
dobramento da cadeia polipeptídica dentro da organela. Fonte: Suzue
e Young (1996)........................................................................................ 23

Figura 9 Fluxograma para o desenvolvimento de estratégias de abordagens
genômicas e pós-genômicas visando alcançar o diagnóstico, profilaxia
e terapêutica da leishmaniose visceral
................................................... 35

Figura 10 Esquema representativo de todas as etapas exigidas desde o término
do sequenciamento até o alinhamento local de sequências (BLAST).... 37

CAPÍTULO I

Figura 1 Diagrama representando a composição do cluster 70cit, que inclui a
ORF completa da HSP70 de L. chagasi. Todos os clones estão
representados na posição em que suas extremidades 5´ não
traduzidas se inserem no cluster. As regiões 5´não traduzida e 3´não
traduzida estão destacadas nas extremidades do cluster. A posição
do hexapeptídeo EADDRA (seta) está indicada para todos os clones.
Fonte: Queiroz, 2003............................................................................... 85